科研 | EBioMedicine：禁食揭示了低体重和正常出生体重男性脂肪和肌肉中代谢转录调控的差异
编译：白羽，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Fasting unmasks differential fat and muscle transcriptional regulation of metabolic gene sets in low versus normal birth weight men
译名：禁食揭示了低体重和正常出生体重男性中代谢基因组脂肪和肌肉转录调控的差异
期刊：EBioMedicine
IF：6.68
发表时间：2019年8月
通信作者：Linn Gillberg；Charlotte Ling
通信作者单位：哥本哈根大学医学院；隆德大学医学院
实验结果
首先，全部参与者禁食36小时（禁食实验，20名LBW和17名NBW男性），其中一部分参与者在2-4月后进行对照研究，既摄入相同热量食物后禁食过夜（对照实验，8名LBW和8名NBW男性），随后，检测其出生体重组之间的生理和代谢差异及其对禁食的反应（Fig.1）。他们的临床特征分别列于表S1和表1中。结果表明，LBW和NBW个体的年龄和BMI相匹配，并且所有参与者（表S1; 20个LBW与17个NBW）以及对照实验组（表1；8个LBW和8个NBW）的葡萄糖，胰岛素或脂质谱没有显著差异。此外，在对照实验中，LBW和NBW男性之间的EE，RQ和葡萄糖/脂肪氧化比没有显著差异（表1）。随后，作者研究了在整个研究人群中禁食36小时后出生体重组之间的生理差异。发现，LBW组与NBW相比，EE、FOX和甘油三酯水平显著降低（表S1）。禁食后各组间葡萄糖氧化和血液中FFA，葡萄糖和胰岛素水平相似。与对照实验相比，禁食后，血浆葡萄糖和胰岛素水平急剧下降，LBW和NBW男性的肝脏变得更加对胰岛素敏感（基于HOMA-IR指数，表1）。仅LBW男性禁食时EE显著增加（p=0.02）。两组中葡萄糖氧化显著减少，脂肪氧化水平显著增加，这反映在禁食后RQ显著降低（表1）。甘油三酯水平仅在LBW男性中显著下降，而两组中FFA水平均超过3倍（p≤0.005）。总之，出生体重组之间存在生理差异，主要体现在禁食后和对禁食的反应。
Fig1. 实验设计
在对照和禁食研究中，研究者分别检测了8名LBW和8名NBW以及20名LBW和16名NBW受试者SAT和骨骼肌中的基因表达，先测试了相关基因（KEGG通路）是否通过GSEA在LBW与NBW中具有不同的表达。在对照研究中，SAT显示有27个基因在LBW与NBW中表达显著降低（Fig.2;表S2，表A）,包括参与氧化磷酸化的基因（OXPHOS，Fig.3A和B）和碳水化合物、脂质和氨基酸代谢中的多种中心代谢通路基因。禁食后，包括几种这些代谢通路在内的17个基因组的表达在LBW与NBW的SAT中反常增加（Fig.2,3A和B,表S2，表B）。在对照研究中，参与遗传信息处理的六条通路在LBW的SAT中下调（Fig.2;表S2，表A）。然后研究者测试了在对照研究和/或禁食后LBW与NBW的SAT中个体基因的表达是否不同。一些基因显示出组间的名义差异，但在多次测试校正后没有显著差异（数据未展示）。
与SAT相似，在对照研究中，发现LBW与NBW男性的骨骼肌中OXPHOS通路中的基因表达较低，同时叶酸合成减少（Fig.4;表S2，表C）。相反，禁食后，LBW肌肉与NBW相比，OXPHOS表达无显著差异（Fig.3A和C），包含在核糖体通路和ECM受体相互作用的3个基因表达显著降低（Fig.4;表S2，表D）。在对照研究和/或禁食后，一些个体基因在来自LBW与NBW的骨骼肌中的表达在多次校正测试后没有显著差异。在LBW中SAT和肌肉中OXPHOS的低表达与T2D患者的SAT和肌肉中OXPHOS的低表达表现一致，表明其更易患糖尿病。如上所述，在校正测试后，LBW与NBW中OXPHOS基因的mRNA表达没有统计学差异。
为了确定可控制LBW和NBW受试者之间SAT和肌肉转录差异的转录因子，作者使用了PSCAN和JASPAR。在这里，研究者搜寻了富集到GSEA通路中的基因较高频次出现的特异性转录因子结合序列（原文表S2，表A-D）。在对照组研究结束后，针对LBW和NBW中表达较低的20个KEGG通路的富集基因，包括KLF14在内的3个转录因子的识别序列在SAT中显著富集（原文表S3，表A），而LBW禁食后SAT表达较高的基因中富集的基因则指向7个转录因子结合基序（原文表S3，表B）。在对照研究中，在肌肉中，NRF1被富集到在对照研究后在LBW中表达降低的三个基因中（表S3，表C），而禁食后LBW与NBW相比下调的三个KEGG通路中共发现有13种基序（表S3，表D）。有趣的是，其中3个转录因子在LBW和NBW男性肌肉中也有差异表达，其中NRF1在对照组研究后在LBW中表达更高，而ELK1和ELK3在LBW和NBW禁食后均有较高的表达（表S3，C和D）。
研究者之前已经证明，当组合来自24名NBW和16名LBW的数据时，连续5天高脂肪摄入（HFO）导致SAT中超过16%的基因存在差异表达。在本研究中，使用先前研究的SAT表达阵列数据并进行GSEA分析以研究在禁食条件下，过度饮食的LBW与NBW中差异表达的一些KEGG基因集，在禁食条件下是否也存在出生体重组之间的差异。与图2中显示的数据一致，OXPHOS和其他中心代谢通路如TCA循环，丙酮酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成在隔夜禁食组LBW与NBW中低表达（Fig.3A和D）。此外，LBW与NBW的免疫系统相关的几种通路中基因表达增加，而在本研究中，禁食后LBW与NBW中的一些基因也被上调（Fig.2）。有趣的是，在5天HFO饮食后，代谢通路中基因的表达在不同出生体重组之间不再表现出差异（Fig.S1;表S4，表D）。然而，在对照饮食和HFO之后，LBW的SAT与NBW相比，抗原加工和呈递途径上调，以核糖体途径下调（Fig.S1）。
Fig2.禁食后皮下脂肪关键基因和KEGG通路的变化
为了研究LBW和NBW中SAT和肌肉的基因表达对禁食是否有不同的反应，研究者接下来比较了禁食后每个出生体重组中与对照研究相比的表达水平。首先，研究者基于对照研究中与禁食比较的所有转录本的配对分析数据进行了GSEA通路分析，与对照研究相比，20个KEGG通路被下调，并且在禁食后没有一个被上调（Fig.2）,主要涉及代谢，包括OXPHOS，碳水化合物，脂质，氨基酸和核苷酸代谢（Fig.2）。为了观察代谢相关基因中特定基因如何通过两组的禁食进行调节，作者绘制了LBW和NBW中所有OXPHOS基因的表达倍数变化（log2）（Fig.5A）。很明显，相同的基因在LBW和NBW个体SAT中的表现不同。在LBW的SAT中，与对照研究相比，禁食后没有代谢通路显著降低，并且在禁食后上调的14个通路中，只有两个涉及代谢（Fig.2）。有趣的是，尽管参与禁食的LBW在SAT中蛋白酶体通路显著上调，但是在禁食的NBW中，其在SAT中被下调（Fig.2）。因此，响应禁食的全基因组表达变化在LBW和NBW的SAT中表现极其不同（Fig.2,5D）。
Fig4.禁食后骨骼肌中关键基因和KEGG通路的变化
Fig5. LBW和NBW脂肪组织和骨骼肌对36小时禁食有不同的转录反应，但脂肪组织对5天高脂肪过量摄入有相似的反应。
基于GSEA的禁食反应带来的基因变化在LBW和NBW的骨骼肌中比在SAT中更相似。在NBW个体的肌肉中，13个KEGG通路通过显著下调响应于禁食，并且大多数与代谢相关（Fig.4）。此外，ABC转运蛋白（参与膜转运）在NBW禁食时上调（Fig.4）。与SAT类似，OXPHOS是NBW禁食时肌肉中下调最显著的通路。当绘制LBW和NBW中OXPHOS基因表达倍数变化（log2）时（Fig.5B）发现，LBW和NBW肌肉中OXPHOS对禁食的反应是不同的。在LBW的肌肉中，禁食与对照研究之后，15种通路被下调。这里，许多通路涉及细胞过程，但也涉及代谢（Fig.4）。值得注意的是，在禁食与对照研究之后，来自LBW和NBW受试者的肌肉中的5种通路显著下调，例如， TCA循环，GAP连接，氨酰基tRNA生物合成和心肌收缩（Fig.4）。总之，研究者发现LBW与NBW骨骼肌中某些基因对禁食有不同的转录调控（Fig.5E），但不像SAT那样明显（Fig.5D）。当继续研究个体基因的表达变化时发现，在SAT和骨骼肌中，我们发现了数千个名义关联。在多次校正检验后，在骨骼肌中作者发现20个转录产物在禁食的LBW中显著改变，共134个转录产物在NBW中随禁食而改变（表S5）。两组中四个转录本同向变化（全部上调）。
为了研究LBW与NBW中SAT基因表达的差异是否对禁食有特异性，研究者对来自上述独立的LBW和NBW过量摄入组SAT mRNA表达数据集进行了新的分析。在此前的研究中，16名LBW和24名NBW随机接受5天HFO和对照饮食，并且在隔夜禁食后切除SAT活组织分析mRNA表达。与禁食后观察到的结果相反（Fig.2），HFO导致LBW和NBW的SAT中出现相似的基因表达变化（Fig.S1）。OXPHOS，TCA循环，丙酮酸代谢，不饱和脂肪酸和蛋白酶体的生物合成是两个出生体重组接受HFO后最显著上调的KEGG基因集，在NBW的 24个显著上调的KEGG通路中，23个在LBW中也显著上调（表S4）。有趣的是，在NBW接受HFO后在SAT中上调的24种通路中，有13个在NBW中因禁食而下调（表S4），而在LBW中，HFO的40种上调通路中没有一种因禁食而显著下调。在LBW(核糖体)和NBW(醚脂代谢)中，分别只有一个通路对HFO存在显著的下调。通过绘制所有OXPHOS基因的倍数变化，显示出这些基因在LBW和NBW中被类似地调控（Fig.5C）。在NBW和LBW中，SAT的所有转录变化与HFO摄入存在高度相关性，两组变化类似（Fig.5F），但是接收36h禁食后，SAT的转录变化则完全相反。这些数据表明，响应于HFO的SAT中的转录变化在LBW和NBW之间是相似的，而LBW与NBW的SAT对禁食反应不同。
已经证明表观遗传改变能够通过影响子宫环境影响后代晚年代谢疾病风险。因此，在寻找LBW和NBW之间禁食的不同基因表达反应的分子机制时，作者研究了所选的差异表达基因和区域的DNA甲基化水平。
首先，作者从对照研究后的LBW和NBW中提取了一组基因，这些基因的表达水平驱动了SAT中OXPHOS通路下调的显著富集，也驱动了LBW和NBW禁食后OXPHOS通路的上调（表S2）。接下来，从39个符合这一标准的OXPHOS基因注释位点(735个CpG位点)中提取DNA甲基化数据。在对照研究后发现，SAT中27个CpG位点在LBW和NBW中存在名义上的差异甲基化，34个CpG位点在禁食36小时后存在差异甲基化（表S6，表A）。这些表观遗传差异在多次测试校正后没有显著性差异，CpG位点没有重叠，也就是说，它们只是在LBW和NBW的对照研究或禁食后的SAT上才有差异的甲基化。然而，尽管在不同的基因组上，两组共17个OXPHOS基因仍然表现出不同的甲基化水平。
其次，作者提取了CpG位点的甲基化数据，这些CpG位点注释为驱动KEGG蛋白酶体通路的基因，该基因在NBW的SAT中下调，而在禁食与对照研究后，在LBW的男性中上调(Fig.2F)。对于驱动蛋白酶体通路富集的12个基因，发现禁食后与对照研究相比，NBW中11个CpG位点和LBW中7个CpG位点出现了名义上的甲基化改变(表S6，表b)；两组之间没有重叠。这些位点大多注释为PSMD7、SIRT3/PSMD13和PSME3(分别为4、3和3个CpG位点)。这些结果表明，DNA甲基化对LBW和NBW在禁食后SAT中差异基因表达的影响不大。
最后，作者研究了肌肉中单个基因注释的CpG位点的DNA甲基化，这些位点分别在禁食和对照研究后显著改变表达（表S5）。在LBW中，20个个体基因在禁食和对照研究后在肌肉中有差异表达。通过对其中17个基因的注释，发现了18个CpG位点，在禁食和对照研究后，这些CpG位点与LBW男性的肌肉中存在名义上的甲基化差异（表S6，表C），包括YPEL1，MAML3，LMTK2和ZFAND5。在NBW中，67个CpG位点注释到92个个体基因，其在禁食后与对照研究相比肌肉中表达发生了改变，也显示甲基化的名义差异（表S6，表B）。这里，五个CpG位点注释为MAML3，两个注释为YPEL1。尽管在出生体重组和对禁食的反应中发现了一些表观遗传差异，但这些变化的幅度和显著性非常微妙，不像LBW与NBW中检测到的差异基因表达变化那么明显。
结论
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