科研 | NAT COMMUN：利用心脏簇增强心肌修复
编译：稻和，编辑：景行、江舜尧。
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针对心衰的细胞疗法是当下研究的热点，但其在促使受损心脏结构与功能恢复的研究上进展缓慢。维持注射细胞状态与细胞存活是细胞疗法的一个亟待解决的问题，单层细胞培养与2D细胞注射培养均不能实现很好的效果。本研究报道了一种传递发挥协同效应的组合细胞群的方法，这种方法能够使受损后心肌结构与功能显著改善。
由于研究小组之前报道了同时从人类心脏组织中分离和扩增三种心脏不同来源间质细胞的方式，这促使他们设计了一种3D 结构，该结构可以最大限度地发挥细胞间质相互作用，确定细胞比例，控制细胞大小，增强可注射性，并最大限度地减少细胞损失。间充质干细胞(MSCs)、内皮祖细胞(EPCs)和c-Kit+心脏间质细胞(cCICs)放在一起自然培养时形成无支架的3D微环境，称为心脏簇。单细胞转录组研究表明心脏簇分泌干细胞相关因子，粘附/细胞外基质分子和细胞因子，同时维持更自然的转录组类似于内源性心脏细胞的特性。心肌内注射心脏簇能够在维持心肌细胞大小与长期心功能的同时改善梗死鼠的毛细血管密度与减少细胞丢失。临床前的心脏簇应用为人们提供了基础见解，同时为以减轻心肌损伤作为目标的细胞疗法的优化奠定了框架。
论文ID
原名：Enhancing myocardial repair with CardioClusters
译名：利用心脏簇增强心肌修复
期刊：Nature Communications
IF：11.329
发表时间：2020年8月
通讯作者：Mark A. Sussman
通讯作者单位：圣地亚哥州立大学圣地亚哥心脏研究所
DOI号：10.1038/s41467-020-17742-z
实验设计
结果
心脏簇是由同时分离的三个心脏驻留细胞群组成，三群细胞均具有表型特征。组成心脏簇的间充质干细胞(MSCs)、内皮祖细胞(EPCs)和c-Kit+心脏间质细胞(cCICs)均表达与之前文献报道相似的表面Marker谱。研究人员通过慢病毒载体修饰引入荧光蛋白对三个细胞群进行追踪，明场与荧光情况下可见每个细胞种群都有明显的形态学（图1a-图1c)。形态上面，细胞形态测量面积，圆度，和L/W的比率为每种细胞类型证实了不同的表型(图1d-图1f)。生理层面，研究人员进一步比较了三种细胞的增值、凋亡、坏死与健康状态，显示三群细胞具有不同特征（图1g-1j)。总而言之，特性分析显示了心脏间质细胞群在表型和生物学上的差异，这些差异例如对氧化应激诱导的细胞死亡的抵抗能力增强，高增殖活性，EPCs的促血管生成性质，是心脏簇设计和应用的基础。
接下来，研究人员描述了心脏簇的两步形成过程。心脏簇形成首先得植入cCICs和MSCs形成内芯，24小时后再加入EPCs，为心脏簇提供富含内皮细胞的外层（图1k）。相对于心脏簇内芯更敏感的cCICs和MSCs，外层EPC增强了心脏簇的抗氧化应激能力。形成心脏簇的单个细胞可以通过它们自身的同源荧光基团标记实现可视化，无需通过抗体介导检测（图l-图1m）。心脏簇大小可重复地和预测性地对应于每微孔细胞播种数（图1n）。由于往小鼠心脏心肌内注射细胞使用的是标准的30号针，所以注射的心脏簇直径应该在30号针的直径范围内以保持三维结构。根据形态计量定量分析，最多400个细胞形成的心脏簇能在不改变三维结构的情况下通过30号针（图1o）。通过时间维度的录像显微镜，研究人员观察了心脏簇的形成过程。此外，研究人员还发现三维心脏簇能够很好的维持细胞存活，冰冻的心脏簇与未冰冻的心脏簇细胞存活相当。这支持了将冷冻心脏簇用于治疗目的的可行性，而无需在使用前重新制造。
图1.三群不同的心脏细胞系产生心脏簇。 a-c. cCIC (eGFP+) (a)、EPC (mOrange+) (b)和MSC (Neptune+) (c)的代表明场和免疫荧光图像。比例尺:明场 100um; 免疫荧光, 50um。用DAPI观察核(白色)。d-f.三群细胞的细胞形态参数测量面积(d)、圆度(e)和长宽比 (f) 数据d, e代表平均值(n = 3个独立的人类心脏分离;每个心脏的每种细胞类型至少30个细胞)±SEM，数据以所有对的Bonferroni比较的单因素方差分析的形式呈现，***p < 0.0001。 g.利用CyQuant检测第0天，第1天，第3天和第5天三群细胞的每种细胞对于心肌细胞增殖的影响。数据代表平均值 ±SEM(n = 3个独立心脏样本，重复运行) ±SEM 。h-j.Annexin V/Sytox蓝标记的凋亡(h)、坏死(i)和健康(j)细胞 细胞死亡实验:低血清24小时(75%血清减少)，然后在低血清培养基中使用30uM H2O2处理4小时。数据代表平均值 ±SEM(n = 4个独立的心脏样本，每个实验重复运行)。数据以单因素方差分析与Tukey多重比较检验。K.从人类心脏组织中分离的三种细胞群:MSC(红色)，cCIC(绿色)，EPC(蓝色)形成心脏簇的示意图。l.内源性荧光标记显示cCIC (eGFP;FITC通道;绿色),MSC(蓝色;APC通道;和EPC (mOrange; PE通道;蓝色)。标尺，75um。m；3D心簇的横切面在4%多聚甲醛中固定，在不需要抗体标记的情况下用4 '，6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)显示荧光标记的细胞核和自身所带的荧光基团标签显示细胞。标尺，75um。n；在7天的时间内培养出100到1000个细胞大小的具有代表性的心簇明场视野图像。标尺，100um。O.心簇通过内径为159um的30号针所测定的细胞数目，相应细胞数目培养3天后形成的心簇平均直径绘制图。
2 心脏簇在体外发挥保护作用
以往研究发现cCICs和MSCs对共培养的血清饥饿的新生大鼠心肌细胞(NRCMs)具有保护作用。为了证实细胞拯救作用，研究人员通过心脏簇与NRCMs共培养来评估心脏簇介导的有益作用，并与cCIC、EPCs、间充质干细胞以及cCIC + EPC + MSC (C + E + M)联合培养的效果进行比较（图2a）。与所有其他处理组相比，低血清处理的NRCMs在心簇共培养24小时后恢复心肌细胞大小，并增加肌特异性III型中间丝蛋白Desmin与Sdf-1(MSCs的一种心血管保护细胞因子和趋化因子，对血管生成很重要的EPCs招募起额外作用)的mRNA表达（图2b-2e）。总之，体外实验证明心脏簇发挥更强的保护作用对于饥饿处理的NRCMs。
图2. 体外水平，心脏簇保护低血清处理的心肌细胞。 a.4天(D)期间新生大鼠心肌细胞(NRCM)低血清检测时间轴。b.代表图像NRCM条件:血清饥饿 (48 h(0.5%),获救(24小时0.5%血清添加额外的10%血清24 h),实验组和(24 h用0.5%血清处理,另添加EPC, MSC, C + E + M,或心脏簇额外处理24 h)。通过染色肌动蛋白辅肌动蛋白(α-actinin;红色) 可视化心肌细胞。TO-PRO-3碘(Topro;(白色)用来观察细胞核。标尺，50um。c.定量心肌细胞大小相较于血清饥饿对照组。d-e.加入细胞和不加入细胞的心肌细胞中desmin (d)和sdf-1 (e)的基因表达。c中的数据代表平均值±SEM(n = 3个独立的NRCM制备)。数据单因素方差分析表示，与血清缺少组相比，c *p = 0.028, d **p = 0.003, e *p = 0.038。
3 共培养后的心脏簇，旁分泌表达增加
由于旁分泌因子的活动被认为是心脏保护的一种主要机制，所以作者检测了血清耗尽后NRCM与心脏簇共培养5天后生长和免疫调节因子mRNA转录水平的表达。与心脏保护相关的因子如白介素-6（IL-6）、胰岛素样生长因子（IGF）、SDF-和肝细胞生长因子（HGF）在心脏簇共培养中显著增加，这是相较于cCICs或 EPCs或 MSCs与NRCMs单独共培养以及三种细胞混合与NRCMs共培养产生的结果。
4 心脏簇对氧化应激有抵抗作用
为了探究心脏簇对于氧化应激的抵抗作用，研究人员利用Annexin V和Sytox蓝染色评估了上文所描述的几种共培养在夜间低血清培养后，再经H2O2处理4小时的细胞凋亡与坏死情况。研究人员发现心脏簇与细胞共培养的凋亡与坏死程度显著低于其他几种共培养方式（图3a-3b）。通过观察组织培养皿盘中细胞细胞贴壁与脱离情况，研究人员进一步表明心脏簇能够在体外更好地抵抗氧化应激并有潜力作为一种治疗手段（图3c-d）。
图3.心脏簇能够抵抗氧化应激 a-d.细胞死亡评估实验是在心脏细胞群经历24小时低血清（降低75%）处理，4小时30uM H2O2处理之后进行评估的。 a-b.利用Annexin V染色检测凋亡与利用Sytox蓝染色评估坏死。c-d.单个细胞与细胞簇处理下的明场情况 H2O2处理后4小时，透明箭头突出贴壁(健康)细胞，黑色箭头突出聚集并从组织培养表面脱落的细胞，最有可能发生细胞死亡。
5 心脏簇改善心肌损伤后的参数
研究人员接着评价了小鼠心肌梗死模型中心肌簇的治疗效果。在小鼠心肌梗死时，研究人员对NODSCID受体小鼠进行了异种人细胞治疗，并将心脏簇组与C + E + M联合组作为单一细胞悬液混合物给予直接比较。通过胸骨旁长轴超声心动图对4个实验组(无损伤假手术组、心脏簇组、C + E+ M组和载体治疗组)不同时间的心肌结构和功能进行评估可以发现如下状况（图4a）。在心梗手术处理1周之后，所有进行过心梗手术的组别心功能均下降。在心梗手术处理4周至20周，通过观察其相应的心功能参数（射血分数（EF）、缩短分数（FS）、射血分数（EF））可发现心脏簇处理组心功能持续提升并显著恢复（图4b-4d）。在研究结束时，与第1周的起始值相比，心脏簇治疗的EF相较于其他组别改善程度显著，高达45 ± 7%（图4e）。此外，心脏簇治疗组在收缩期(LVID;s)和舒张期(LVID;d)左室内径均明显缩小，左室收缩期末和舒张期容积均减少（图4f-4g）。心脏簇治疗恢复心肌结构以及功能优于C+E+M进一步在形态测量学和血流动力学进行了验证。心肌肥厚不是导致心梗手术20周后心脏簇治疗组心肌前壁厚度(AWT)增加的因素(图4d)，因为相对于假手术组心脏重量与胫骨长度之比(HW/TL)没有增加（图4h）。在心梗手术治疗20 周时，心脏簇治疗组纤维化区域明显小于对照空载体治疗组，而C+E+M治疗组与心脏簇治疗组纤维化面积并无显著差异（图4i-4m）。相应的血流动力学指标如随着时间变化的上升血压在心脏簇治疗组中显著高于空载体治疗组。总之，这些结果表明，心肌簇治疗在小鼠心肌梗死损伤模型中对其心肌功能的恢复有更大的益处。
基于斑点追踪的应变分析是一种高度敏感的超声心动图技术，可用于评估左心室(LV)功能。所有鼠在心梗一周后心功能均发生同等下降。与口服药物治疗的动物相比，心脏簇治疗组的收缩变形从心肌梗死后第8周开始显著改善，并持续到心肌梗死后第20周(图5b-d)。心肌梗死后第8周和心肌梗死后第20周的径向应变测量证实，与2D培养的C + E + M混合细胞群相比，心脏簇治疗具有更显著的功能（图5 c）。损伤区域的局部应变测量进一步证明心脏簇治疗能显著提高动物左心室功能,纵向应变心肌梗死后第20周的绝对差异中也看到了类似的改善（图5e-图5h）。
图4. 心脏簇治疗改善心肌损伤后左室壁结构和心功能 a.研究结束时(第20周)代表性二维超声心动图(m模式)。胸骨旁短轴切面显示左室前壁和后壁移动。b-d. 20周内纵向评估左室缩短分数(FS，%) (b)，射血分数(EF，%) (c)，收缩期前壁厚度(LVAW;s, mm) (d) e. EF从第1周到第20周的变化。数据代表平均值(n = 7心脏簇治疗组小鼠;n = 7只C + E + M治疗小鼠;n = 8只空载体处理小鼠) ± SEM。数据作为单向方差,与Dunnett的比较测试相结合,* * p = 0.003,与心脏簇组相比。f-g.条形图显示左心室收缩期容积(Vol;s, l;f)和舒张期容积(Vol;d, l;g).数据表示平均值± SEM(补充数据3中规定的小鼠数量) 。数据以双因素方差分析与Dunnett’s比较检验。h.第20周的心脏重量与胫骨长度之比(HW/TL;mg/mm)。数据表示平均值± SEM(如图所示的n只小鼠) 。数据采用Dunnett比较检验的单因素方差分析，*p = 0.012， **p = 0.009，与sham组相比。i-m.Masson三色染色评价左室纤维化面积。心脏簇、C+E+M与空载体治疗组左心室心肌纤维化的百分比(i)。数据代表平均值± SEM(n只小鼠如上所说) 。数据采用单因素方差分析与Dunnett 's比较检验，*p = 0.028，与CardioCluster比较。心肌梗死20周后，对照组 (j)、空载体组(k)、心脏簇(i)和C + E + M (m)治疗心脏的代表性组织学切片。
图5. 通过心脏负荷测量心脏簇对心功能的影响。a-b.代表图像的长轴超声超声造影记录(左面板),有横截段同步图(中板),以及在第1周(a)和第20周(b)的纵向应变曲线(右面板)。c-d.用散斑追踪超声心动图分析确定第1、8、20周的整体径向应变峰值(%)(c)和整体纵向应变峰值(%)(d)。数据表示均值(n只小鼠，如上所述) ± SEM。e-f.利用散斑追踪超声心动图分析用于确定损伤区域在第1周和第20周的径向和纵向应变(%)峰值。数据以Tukey’s比较检验的双因素分析表示。g-h.第1周至第20周损伤区区域径向和纵向应变的总变化。数据以单因素方差分析和Dunnett比较检验表示。
6 心肌内注射后心脏簇的植入与维持
与分离的单细胞悬液如C + E + M混合细胞群相比，心脏簇的多细胞3D结构和增强存活率的特性是诱导传递后细胞存活增强有吸引力的特征。在体内，研究人员通过共聚焦显微镜纵向评估了20周的心脏簇持久性。在试点研究中，心脏簇的定位可通过共注射荧光球示踪珠来确定组织切片中的传递位置（图6a-6d）。冰冻心脏切片可以直接可视化荧光团标记而无需抗体标记，通过冰冻心脏切片研究人员发现体外心脏簇与注射进体内的心脏簇组成与位置没有区别。由于心脏簇定位与注射部位一致，研究人员随后在不使用荧光示踪珠的情况下注射和成像，进行长期功能研究。注射后第1天、3天、1周、4周、12周和20周，心肌内均可见明显的心肌簇（图6e-图6k）。抗体标记证明注射20周后，心脏簇仍持续存在（图6h-图6k）。
图6. 心脏簇显示心肌壁的移植物和持久性增强。 a. 注射后第3天，用荧光球示踪未受伤动物冷冻心脏的免疫荧光平面扫描，细胞可视化不需要抗体标记。b-d.白色点框内区域的更高放大倍数。b为了更好地显示cCIC(绿色)和MSC(蓝色) 去除555 nm通道，没有荧光球。c、d共555 nm通道恢复(c)和视场放大(d)。e-g.注射心脏簇的MI心脏冰冻切片的心肌免疫荧光图像，第1天(e)，第3天(f)和第1周(g)。h-k. 在第1周(h)、第4周(i)、第12周(j)和第20周(k)注射心脏簇的MI心脏的抗体标记免疫荧光图像。h右面板显示白色点框区域的高倍放大。j右面板显示在白色虚线框中显示的cCICs放大倍率更高。k右面板显示在白色虚线框内更高的cCICs和EPCs放大倍率。
7 心脏簇能够在梗死区增加毛细血管密度
研究人员进一步探究了注射不同组分对于梗死心脏梗死区、边缘区和远处的毛细血管密度影响。与空载体和C + E + M治疗组相比，心脏簇治疗组在心肌梗死20周后的梗死区显示了更多的异体素标记的血管（图7a，图7e-图7g）。心脏簇和C+E+M治疗组在周边区相较于空载体组毛细血管密度存在显著差异，但是两者之间并无显著差异（图7b）。在远端区，三种注射方式与假手术组的毛细血管密度之间均无显著差异（图7c-图7d）。总而言之，这些数据表明与分离的混合细胞制剂或空载体对照组相比，心脏簇治疗可促进更高水平的微血管形成。
图7.心脏簇治疗能够增加梗死区毛细血管密度 a-c. 定量分析测量梗死区(a)、边缘区(b)和远端区(c)的毛细血管密度。d-g. 定量假手术梗死区(d)和空载体梗死区(e)、心脏簇治疗组梗死区 (f)和C + E+ M组梗死区 (g) 毛细血管的代表图像(同工凝集素 +血管)( 同工凝集素B4;绿色)，心肌肌钙蛋白T (cTNT;红色)，细胞核(DAPI;白色)。右侧面板显示黄色框高亮区域的同工凝集素 +血管的高倍放大图像。比例尺200微米。
8 心脏簇的治疗维持心肌细胞大小
细胞治疗可减少病理损伤后的肥厚性重塑，可阻止心肌梗死后心衰的进一步发展。研究人员计算了单个心肌细胞的横切面面积以及梗死区、边缘区和偏远区心肌细胞的平均横切面面积（图8a-图8c）。无论是接受心脏簇治疗组还是接受C + E + M混合细胞群治疗组，心肌梗死20周后梗死区心肌细胞大小均与未受损伤的对照组心脏几乎相同（图8a）。与使用C + E + M或空载体的对照组相比，心脏簇治疗组心肌细胞在梗死近端边界区或远离损伤部位的远端区域明显缩小（图8b-图8c、图8e-8g）。心脏簇治疗组在偏远区的心肌细胞大小与未受伤对照组的心肌细胞大小相似（图8c-图8d）。总而言之，这些数据证明心脏簇治疗对抑制心肌细胞肥大的作用优于分离的混合细胞制剂或仅空载体对照组。
图8. 心脏簇治疗维持心肌细胞大小。 a-c. 定量分析心肌梗死(a)、边缘区(b)和远端区(c)心脏区域心肌细胞横断面面积的测量。d-g. 定量心肌细胞横断面积的假手术组 (d)和空载体组(e)、心脏簇治疗组(f)和C +E + M (g)的代表性图像(小麦胚芽凝集素[WGA];心肌肌钙蛋白T (cTNT;红色)和核(DAPI;蓝色) 右边的面板显示用黄色框突出显示的放大倍数更高的区域。放大视图显示每个区域三个示踪心肌细胞的面积。条形尺，200um。
9 心脏簇在转录上类似内源性间质细胞
为了了解心脏簇注射改善心脏功能的分子机制，研究人员对单层培养的亲代细胞和心脏簇进行了转录谱分析。考虑到心脏簇是一个异质性细胞群，研究人员采用单细胞RNA测序(scRNA-seq)来揭示心脏簇内细胞转录组的异质性。通过t-SNE降低维可以发现心脏簇（橙色簇）可以通过其独特转录组图谱与其组成的亲代细胞（MSC、cCICs和EPCs分别代表红色、绿色、蓝色簇)区分开来（图9a）。心脏簇有620个差异基因，显著高于MSC、cCICs和EPCs的差异基因（图9b）。这表明心脏簇是一个独特的转录群体，不同于二维条件下培养的亲代细胞。心簇组成的三种亲本细胞特性与观察到的每种细胞类型的转录本一致。EPCs高表达内皮相关基因ECSCR、ESM1、EGFL7和RAC2，这些基因对新生血管系统和血管生成反应很重要（图9b-图9c）。MSCs基因本体论分析显示细胞外基质及黏附分子COL1A2、TIMP3、FN1的表达（图9b，图9d）。cCICs与MSCs均表达其自身相关基因，区别于心脏簇表达的相关基因（图9b-图9d）。为了进一步研究研究人员小组之前鉴定的新鲜分离的心脏间质细胞(Fresh CICs)与培养细胞之间的DEGs与心脏簇内的DEGs差别，研究人员将其进行了比较，发现许多在心脏簇中富集的差异基因在新鲜分离的心脏间质细胞中也被上调（图9f）。心脏簇的448个差异基因中有89个也存在于新鲜分离的心脏间质细胞中,二维培养的亲代细胞只有7个差异基因与新鲜分离的细胞间质细胞相似（图9e-图9f）。这一发现表明标准的组织培养会导致扩增的细胞失去它们的身份，与三维环境中的细胞不同。因此，3D聚集促进了一种更自然的表型，类似内源性或新鲜分离的心脏细胞，使心脏簇更好地适应转移实验和促进功能恢复。
图9. 单细胞RNA测序揭示3D聚类恢复培养细胞的状态达到类似新鲜分离的心脏间质细胞。a-f. 使用scRNA-seq对心脏簇和亲本细胞进行转录分析。a. t-SNE图显示3D心簇内生长的细胞(橙色)，而cCICs(绿色)、EPCs(蓝色)和MSCs(红色)主要聚集在各自独立的组中。b. 心脏簇和亲本细胞间差异表达基因的热图。每组选择的差异基因颜色被编码并显示在右侧。c. 挑选的差异基因表达分布的小提琴图。d.利用基因本体论(GO)术语分析富集的差异基因的分子功能。e-f.与新鲜分离的小鼠心脏间质细胞表达的基因相比，用韦恩图表示 (e)；新鲜分离的细胞与心脏簇和亲本细胞群共同表达的基因集的热图(f)。
结论
本文描述了三种心脏不同来源间质细胞群组成的三维结构细胞群对于增强心肌修复的优势，这种三维结构细胞群称为心脏簇。研究人员具体地在体内以及体外水平描述了心脏簇对于心肌保护以及心脏功能改善的优势。在体外，心脏簇能够发挥保护心肌细胞的作用，对氧化应激具有抵抗作用。在体内，心脏簇注射能够稳定地存在于体内并最大限度地减少注射细胞的丢失，改善心肌损伤后的参数，还能增加梗死区毛细血管密度。除此之外，心脏簇的治疗还能够维持心肌细胞大小，让心脏减少病理损伤后的肥厚性重塑。为了了解心脏簇注射改善心脏功能的分子机制，研究人员还利用单细胞转录组测序发现心脏簇在转录上类似于内源性间质细胞。
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