易基因 - 外泌体let-7d-3p和miR-30d-5p作为宫颈癌及其癌前病变无创筛查的诊断标志物｜早期筛查
易点评
循环外泌体RNA（尤其是miRNA）已经成为检测早期癌症的最具前景的生物标志物之一。本研究即是一例循环外泌体作为宫颈癌早期筛查潜在标志物的开发案例。
背景
宫颈癌(CC)是20至39岁女性患癌症致死的第二大病因。其发病率和死亡率分别为98.9/10万和30.5/10万，且在中国有上升趋势。宫颈上皮内瘤变(CIN)的CC筛查对于识别高级别宫颈上皮内瘤变(CIN)、防止其发展为浸润性癌具有重要意义。筛查方式一般为巴氏涂片(巴氏涂片)和Thinprep细胞学试验(TCT)，通过筛查可以极大地降低宫颈癌的发病率，并提高宫颈癌的5年存活率。然而，巴氏涂片和TCT的诊断率仍然较低，这是由于早期筛查并不是在中国所有的地区都得到了普及，特别是在农村地区，大多数女性在出现阴道异常出血、白带、腹痛等症状时才会进行检查。
外泌体是存在于所有体液中的30-150 nm的微小囊泡，是精准医学液体活检的关键指标之一。外泌体可以提供丰富的遗传物质，包括DNA片段、mRNA、长非编码RNA、小RNA、蛋白质和脂质等，它们与癌症的发生和发展密切相关。与长非编码RNA、无细胞DNA的异质性突变位点和mRNA的不稳定特性等复杂机制相比，外泌体miRNA稳定且相对不可降解，检测方法相对成熟，并且最近的研究表明，外泌体miRNA有可能成为癌症筛查、诊断和监测的有效生物标志物。例如，5-miRNA可以区分惰性前列腺癌和侵袭性前列腺癌。miR-122、miR-192、miR-17-5p和miR-25-3p分别在不同的肿瘤组织中富集。一些来自血浆或血清的miRNA已经显示出它们作为宫颈鳞癌(SCC)手术前后和早期发现非小细胞肺癌的非侵袭性生物标志物的潜力。
在本研究中，作者对癌症生物标记物开展了大规模的血浆miRNA研究。对121例健康志愿者、宫颈癌患者和癌前病变患者的血浆样本进行了外泌体miRNA测序。然后用qRT-PCR验证了46例宫颈癌及其癌旁组织中差异表达的miRNA(DEmiRs)。此外，使用ddPCR进一步验证了其中两个DEmiRs(miR-30d-5p和let-7d-3p)在203份独立的血浆样本中的差异性，证实了这两种外泌体miRNA的联合应用在宫颈癌的早期检测中是有效且具有前景的。
结果
外泌体中差异表达miRNA的鉴定
首先，对检测到的所有DEmiRs进行主成分分析(PCA)和聚类分析，并将血浆样本按照相似miRNA表达模式进行分配(图1)。作者发现，CIN II-III和CC组样本具有共同的miRNA表达情况。此外，作者还比较了健康受试者和CINⅠ受试者miRNA的表达，但没有发现DEmiRs(FDR>0.05)。这些结果印证了分组策略，即将CIN II-III、ACC和SCC患者合并为一组，而将健康受试者和CIN I患者合并为另一组。最后，CIN I-与CIN II+组比较发现了37个DEmiR(FDR<0.01)，其中9个表达上调，28个表达下调。
外泌体miRNA鉴别CIN I-和CIN II+患者的诊断准确性
接下来，使用随机森林算法从121个血浆外泌体测序样本的37个DEmiR中选择一组miRNA，确定了具有8个miRNA(let-7a-3p、let-7d-3p、miR-30d-5p、miR-144-5p、miR-182-5p、miR-183-5p、miR215-5p和miR-4443)的组合，它们是临床诊断中鉴别CIN I-与CIN II+最有效的预测因子。这八个miRNA的等级聚类表明，只有两个CIN II+患者被错误地归入CIN I-组(图1)。ROC分析进一步评估了miRNA标记区分CIN II+和CIN I-受试者的敏感性和特异性，统计出AUC值为0.992(图1)。综上所述，新发现的8个miRNA对CIN I-和CIN II+有很高的预测性。
miRNA的途径富集分析
为了进一步了解这些miRNA在CC中的分子功能，我们对这些miRNA进行了富集分析。在8个DEmiRs的富集途径中，有25个显著相关通路(FDR<0.01)，其中5个是与肿瘤相关的通路，如细胞周期、p53信号通路、AMPK信号通路等，值得注意的是，最主要的靶向途径是病毒致癌，这与HPV引起的CC是一致的。此外，卵母细胞减数分裂和雌激素信号通路也很重要。并且，miR-30d-5p、miR-182-5p和miR-183-5p同时调控RAC1、IGF1R、NRAS、TP53和CCND1基因，这些基因参与了大部分上述重要途径。这些结果表明，这8个外泌体miRNA不仅可以作为潜在的诊断生物标志物，并且由于它们在功能上参与了CC的发生和发展，还可以被当作潜在的抗癌药物靶点。
图1
qRT-PCR验证候选标志物miRNA的有效性
作者使用qRT-PCR评估了46例CC患者的癌组织和癌旁组织中用于区分CIN I-和CIN II+的最佳小组中的8个DEmiRs。其中5个miRNA(let-7a-3p、let-7d-3p、miR-30d-5p、miR-183-5p和miR-182-5p)在血浆外泌体中表现出一致的变化趋势，3个(let-7a-3p、let-7d-3p和miR-30d-5p)在癌组织和癌旁组织中的表达存在显著差异。然而，8个miRNA中的另外3个(miR-215-5p、miR-144-5p和miR-4443)在组织中与血浆外泌体中没有出现明显变化。
ddPCR在独立血浆样本中验证miRNA的有效性
血浆外泌体测序let-7d-3p和miR-30d-5p的表达组合，在121个训练样本中AUC值为0.922。而在203个测试样本中，这两个DEmiR的AUC值为0.828(图2)。此外，在203份有效样本中，基于细胞学测试的样本的AUC值为0.766，而基于miRNA的AUC值增加到了0.834，并且在基于细胞学测试的模型中进一步整合这两个miRNA得到了更高的AUC值0.887(图2)。
外泌体和组织间miRNA表达差异的研究
为了确定miRNA的空间分布和表达水平，作者还用ddPCR方法检测了7个miRNA(miR-320a、miR-128-3p、miR-129-5p、let-7d-3p、let-7i-5p、miR-30d-5p和miR-30a-5p)在CC患者血浆外泌体以及癌旁正常组织中的表达水平。结果显示在组织和外泌体之间存在不同的表达情况。这些miRNA在组织中的比例分别为57.5%、0.5%、2.9%、5.7%、9.1%、10.3%和13.9%，在外泌体中分别为23.8%、22.8%、5.3%、7.5%、4.5%、18.2%和17.9%。外泌体与组织间miRNA表达丰度的Spearman相关系数仅为0.321(P=0.498)，这表明外泌体miRNA可能是由肿瘤细胞选择性分泌的。
图2
结论
本研究是一项癌症生物标记物的大型血浆miRNA研究。鉴定出了外泌体miR-30d-5p和let-7d-3p是宫颈癌及其癌前病变非侵袭性筛查有前景的诊断生物标志物。在临床上，抽血比TCT或巴氏涂片检查更加便捷，并且阴道或宫颈感染的风险更低。同时，它还可以纳入常规血液检测，这大大提高了临床的检验效率。此外，血浆外泌体中的miRNA是稳定的，对物理降解具有抵抗力，这是它们能够成为宫颈癌筛查最有前途的诊断生物标志物的原因之一。然而，在应用到临床诊断之前，还需要使用大样本量进行进一步验证。对这些miRNA的功能研究为宫颈癌进展过程中的机制和生理相关性提供了新的见解。