青春期睾丸发育的动态转录细胞图谱
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摘 要
人体睾丸在青春期会经历剧烈的发育和结构变化，包括体细胞的增殖和成熟，以及生精子形成的开始。为了描述这一未被充分研究的过程，研究者们分析了来自四个青春期男孩的约10,000个睾丸细胞的单细胞转录组，并将其与婴儿和成人的睾丸细胞进行了比较。在青春期，未分化的精原细胞在配子发生开始之前会依次扩张和分化。又将其与基因抑制转雌体睾丸的单细胞进行整合分析。
样品
青春期前和青春期前后的人类睾丸样本分别取自4名健康男孩，年龄分别为7岁、11岁、13岁和14岁。一旦收集到，这完整的睾丸就会被运送到研究实验室的冰盐水或汉克的平衡盐溶液(HBSS;手术切除后1小时内处理。大约90%的睾丸用剪刀分成更小的部分(每个约500 mg - 1g)，直接转入DMEM培养基(Life Technologies cat # 11995073)中含有10% DMSO (Sigma-Aldrich cat # D8779)、15%胎牛血清/胎牛血清(GIBCO cat # 10082147)的低温瓶(Corning cat # 403659)，以受控的慢速保存在Mr. Frosty容器中(Thermo Fisher Scientific cat #5100-0001)，并在在-80℃ 保存过夜。低温瓶被转移到液氮中进行长期储存。
转雌体睾丸
测序
每个单细胞测序实验中，1或2个冷冻瓶快速解冻。然后用PBS洗涤组织两次，如前所述进行消化(Guo et al.， 2018)。对于青春期样本，组织在1x PBS中洗涤两次，并切碎成小块以获得更好的消化结果。用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA;Invitrogen cat # 25300054 ) 20 - 25 分钟 和 胶原 酶 类型 IV (Sigma Aldrich cat # C5138 - 500 - 37 C. MG)对于转基因女性样本，按照(Guo et al.，2018)中描述的标准两步酶分离程序消化组织。然后通过加入10% FBS停止消化(gibcocat# 10082147)。通过70mm (Fisher Scientific cat # 08-771-2)和40mm (Fisher Scientific cat # 08-771-1)滤网过滤获得单个睾丸细胞。600 g离心15 min制粒，PBS洗涤2次。使用 hemocytometer, 清点细胞数量 ，然后在 PBS 中用 浓度0.4% BSA 再次暂停(Thermo Fisher Scientific cat # AM2616) 的~1,000 cells/uL浓度准备单细胞测序。每个样本有二个重复。
使用10x Chromium Controller，约10,000个睾丸细胞
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数据处理&质控
使用mkfastq应用程序(Cell Ranger v2.2.0)对原始数据进行解复用以生成Fastq文件。然后，使用默认设置在count应用程序(Cell Ranger v2.2.0)中运行Fastq文件，该应用程序执行比对(using STAR aligner)、过滤和UMI计数。使用UMI count表进行进一步分析。
使用 Seurat R （v, 2.3.4 ）包进行分析,过滤：500<每个细胞的表达基因数, 每个细胞表达的线粒体基因<25% ，每个样本的重复在t-SNE分析相同后再和其它样本整合，然后所有样本的UML count进行标准化，整合的数据使用 6000个最高表达基因，和1—30 PCs过滤后才进行下游分析。
数据分析
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睾丸样本
聚类：使用Seurat(http://satijalab.org/seurat/ )进行t-SNE 和 聚类分析。
分成了四个cluster, 各个cluster 的marker,每个样本中各cluster 的占比。
逆时序：逆时序分析在Monocle R 包 (v2.10.1)使用默认参数分析。
各样本占比最多cluster的细胞在分化时序中的位置。
分化轨迹分析，各时期基因表达的变化，指定基因表达小提琴图。
细胞周期分析：细胞周期分析使用Scran 包 (https://bioconductor.org/packages/3.7/bioc/vignettes/scran/inst/doc/scran.html, R Package; v1.6.5).
各cluster 和样本所在的细胞周期
细胞亚群分析
对C 5 群进行了再分群，成3个子群，分化轨迹分析，基因集heatmap 分析。
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转基因女性样本
细胞分群
10个cluster 以及 对应marker基因
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整合分析
分群：
各样本的细胞占比：
成人和转基因女性样本的细胞分群图：
各样本细胞的所在分化轨迹的分支
数据可在 GEO: GSE134144 获取。
实验验证
进行免疫荧光(IF)来证实scRNA-seq结果
转基因女性样本和未经处理的样本的免疫染色对比。
总结
亚群分析中研究者们为睾丸间质和肌肉细胞确定了一种共同的青春期前祖细胞，并描述了控制青春期分化的候选因子。此外，青春期前的睾丸Sertoli细胞在青春期间分化成另一种单独的成熟细胞群之前，在代谢谱中表现出两种不同的转录状态。通过对睾酮抑制变性睾丸的单细胞分析，进一步强调睾酮在Sertoli细胞成熟、抗菌肽分泌和精原分化中的作用。综上所述，研究者们对人类睾丸发育转录图谱提供了多种关于发育变化和伴随男性青春期的关键因素的见解。