科研 | Nature Genetics：艰难梭菌形态形成过程中宿主传播周期的适应性 / 开普饭

编译：罗睺，编辑：十九、江舜尧。

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导读

细菌形态形成是一个基本的进化过程，其特征是不同的基因型和表型特性。然而，影响基因适应的选择压力以及它们与支撑新细菌物种形成的生物学变化之间的关系尚不清楚。本研究表明，与孢子形成、医疗相关的肠道病原体艰难梭菌正在积极进行物种形成。通过对906株菌株的大规模基因组分析，作者证明了正在进行的物种形成过程与参与孢子形成和单糖代谢的新形成物种核心基因的阳性选择有关。功能验证表明，新的艰难梭菌产生的孢子具有更强的抵抗力，当葡萄糖或果糖可用于新陈代谢时，孢子的形成和宿主的定植能力均会增加。本研究中，作者报告了一种新出现的艰难梭菌物种的形成，新形态可用于代谢简单的膳食糖并产生高抗性水平的孢子，适于医疗介导的传播。

论文ID

原名：Adaptation of host transmission cycle during Clostridium difficile speciation

译名：艰难梭菌形态形成过程中宿主传播周期的适应

期刊：Nature Genetics

IF：25.455

发表时间：2019年8月

通信作者：Nitin Kumar, Trevor D. Lawley

通信作者单位：英国辛克斯顿维康信托桑格研究所微生物群-宿主互作实验室（Host-Microbiota Interactions Laboratory, Wellcome Sanger Institute, Hinxton, UK）

研究内容

从其原种形成一个新的细菌物种的特点是遗传多样性和生物适应。几十年来，一种依赖于细菌基因型和表型特性的多相检测被用来定义和区分“物种”。细菌分类学最近使用了大规模基因组分析来整合细菌自然历史的各个方面，如生态学、基因水平转移、重组以及系统发育。虽然可以通过基于全基因组的方法对细菌物种进行更准确的定义，但选择压力如何影响生物途径的适应和表型变化，进而导致细菌物种形成。人们对此仍然缺乏全面、详细的理解。在本研究中，作者描述了在现代医疗环境中，一种可在人类种群传播的高度分化的艰难梭菌新物种的形成过程中的基因组进化和生物学变化。艰难梭菌是一种严格厌氧的革兰氏阳性细菌，能产生高抗性、代谢性休眠孢子，孢子能够通过“环境贮存器”在哺乳动物宿主之间快速传播。在过去的40年中，艰难梭菌已成为全球抗生素相关性腹泻的主要原因。为了确定艰难梭菌作为一种卫生健康相关病原体的进化历史和遗传变化，作者对906株从人类（n=761）、动物（n=116）和环境来源（n=29）分离的具有代表性的菌株进行了全基因组序列分析。作者的收集旨在全面捕捉艰难梭菌的遗传多样性，包括13个高质量和注释良好的参考基因组。

基于1322个连锁的单拷贝核心基因的最大似然系统发育(图1a)说明了该集合中存在四个主要的系统发育群。1322个单拷贝核心基因串联排列的群体结构(Baps)贝叶斯分析证实了四个不同的系统发育类群(PG1–PG4)的存在。每个分支菌株都来自不同的地理位置、宿主和环境来源，这表明了共生形态的信号。每个系统发育组也有不同的临床相关核型（RTS）：PG1：RT001, RT002, RT014；PG2：RT027和RT244; PG3：RT023和RT017；PG4：RT078, RT045和RT033。

图1：艰难梭菌的系统发育和种群结构。

系统发育分析表明，近缘种(C.bartlettii、C.hiranonis、C.ghonii和C.sordellii)为外群(图1a)，艰难梭菌的三个系统发育类群（PG1、 PG2和PG3）均来自多样性最高的系统发育群(PG4)。这一点也得到了单核苷酸多态性（SNP）频率的支持，即PG4菌株和其他PG菌株之间成对比较的单核苷酸多态性（SNP）差异频率和PG1、PG2和PG3菌株之间成对比较的SNP差异水平（补充图2）。与生长在营养琼脂平板上的PG1、PG2和PG3的细菌相比，PG4的细菌表现出不同的菌落形态（补充图3），这表明艰难梭菌菌落表型和区分PG1、PG2和PG3与PG4的基因型之间存在联系。

补充图2 艰难梭菌不同系统发育群的成对SNPs差异。

补充图3 艰难梭菌菌落形态

作者之前使用30个艰难梭菌基因组进行的研究发现存在可能出现在1-8500万年前古老的遗传多样性物种，使用更大的数据集对这一估计进行验证，这表明该物种大约在1350万年（1270-1430万）前出现。使用相同的方式对大量扩展的集合进行分析，作者估计PG4的最新共同祖先大约出现在385000年前。相比之下，PG1、PG2和PG3的最新共同祖先大约出现在76000年前。Bayesian分析显示，大约在公元1595年左右，在18世纪现代医疗系统出现之前不久，PG1、PG2和PG3出现种群爆发。综上所述，这些观察结果表明，PG4最先出现，并且PG1、PG2和PG3种群结构在现代医疗系统实施之前开始激增。因此，作者将PG1、PG2和PG3称为艰难梭菌“clade A”，将PG4称为艰难梭菌“clade B”。

为了研究基因组相关性，作者接下来进行了配对ANI分析（图1b）。该分析显示，PG1、PG2和PG3之间的核苷酸同源性较高（ANI > 95%），这表明这些群体中的细菌属于同一物种；而PG4与其它PG之间的ANI值要么小于物种阈值(ANI>95%)，要么处于物种阈值边缘(94.04%~96.25%)(图1b)。为了检测重组事件，对906株菌株的全基因组序列进行了FastGEAR分析。尽管分析发现艰难梭菌A内重组增加，但观察到艰难梭菌A与B之间的重组事件数量有限。这一分析表明核心基因组中存在重组障碍，进一步区分艰难梭菌的两个分支，并可能促进同域物种形成。此外，基因组功能分析也显示了A族和B族之间的清晰分离。作者还观察到clade A中的假基因数量高于clade B中的假基因数量。综上所述，这些结果表明艰难梭菌A和B族的基因组选择压力不同。

除了减少重组事件的发生率外，由阳性选择压力驱动的群体中的优势遗传变异体（称为正选择）也是物种形成的标志。作者测定了Ka/Ks比值（非同义位点非同义亚基数量（Ka）与同义位点同义亚基数量（Ks）之比），并鉴定了A族172个核心基因和B族93个核心基因，这些基因均为阳性选择（Ka/Ks>1）。在clade A中，功能注释和富集分析确定了与碳水化合物和氨基酸代谢、糖磷酸转移酶系统（pts）、孢子外壳结构和孢子组装有关的阳性基因（图2b）。相比之下，硫传递系统是从clade B阳性选择基因中唯一丰富的功能类别。特别是，艰难梭菌clade A阳性选择基因中有26%（总共45）产生了直接参与孢子生长的蛋白质，这些蛋白质存在于成熟的孢子蛋白质组中或受Spo0A调控，或产孢特异性的sigma因子调节（图2c）。相比之下，艰难梭菌clade B分支中没有直接参与孢子产生的阳性选择基因；然而，成熟孢子蛋白质组中存在22.5%（共21个基因）或受Spo0A调控，或其特定于孢子的sigma因子。两个谱系中与孢子形成相关的阳性选择基因之间缺乏重叠，表明孢子介导的传递功能存在分歧。此外，这些结果表明，艰难梭菌clade A进化出了对宿主间传播至关重要的功能。

图2艰难梭菌clade A菌株产孢和代谢基因的适应性。基于1322个核心基因的艰难梭菌clade A和B菌株的阳性选择分析。

a，艰难梭菌clade A（n=172个基因）和B（n=93个基因中阳性选择基因的ka/ks比值分布。

b，显示了艰难梭菌clade A（n=172个基因）和B（n=93个基因）阳性选择基因的富集。y轴表示每个富集功能中阳性选择基因的数量。均具有统计学意义（糖磷酸转移酶系统，Q=0.00167；果糖和甘露糖代谢，Q=0.001173；产孢、分化和萌发，Q=0.0165；半胱氨酸和蛋氨酸代谢，Q=0.00279；硫转运系统，Q=0.00791）。

c，艰难梭菌clade A中阳性选择的产孢相关基因显示为蓝色。在阳性选择的172个基因中，有26%（共45个）参与孢子产生（孢子形成阶段I、III、IV和V），其蛋白质存在于成熟孢子蛋白质组中，或受Sp0A调控或其孢子形成特异性Sigma因子。

作者在clade A中发现了20个阳性选择基因，其产物是成熟孢子的组成部分，可以促进环境生存。例如，SodA（超氧化物歧化酶A），一种与孢子外壳组装相关的基因，在所有A族基因组中有三个突变点，但在B族基因组中不存在。来自不同艰难梭菌科的孢子对来自气体等离子体的微生物自由基的抗性有很大差异。为了研究新谱系孢子的表型抗性特性是否已经进化，作者将两个谱系的孢子暴露于过氧化氢（一种常用的医疗环境消毒剂）中。虽然在30%的过氧化氢条件下存活率没有差异，但来自clade A的孢子对3%（p=0.0317）和10%的过氧化氢（p=0.0317）的抗性比来自clade B的孢子更强（p=0.1667）（图3a）。艰难梭菌产孢主调控因子Spo0A仅在艰难梭菌clade A中处于阳性选择状态。Spo0A还控制其他宿主定植因子，如鞭毛和碳水化合物代谢，可能有助于介导细胞过程，将能量引导到孢子产生和宿主定植以促进宿主之间的传播。有趣的是，clade A基因组含有阳性选择的基因，这些基因与果糖代谢（fruABC和fruK）、糖酵解（pgk和pyk）、山梨醇（CD630_24170）和核糖醇代谢（rep1）以及丙酮酸转化为乳酸（ldh）有关。

为了进一步探讨clade A组中孢子形成与碳水化合物代谢之间的关系，作者利用KEGG通路和人工诱导技术分析了阳性选择的基因。对艰难梭菌clade A组172个阳性核心基因的关键富集途径进行筛选，鉴定出一条完整的果糖特异性PTS途径，并鉴定出4个基因（30%，4/13）参与糖代谢过程中的厌氧糖酵解。与富集的PTS途径相关的其他基因包括用于甘露醇、纤维二糖、葡萄糖醇（也称山梨醇）、半乳糖醇、甘露糖和抗坏血酸的细胞摄取和代谢的基因。此外，对碳水化合物活性酶（CAZymes）的比较分析发现艰难梭菌clade A和B分支之间的CAZymes明显分离。综上所述，这些观察结果表明，艰难梭菌两个分支之间的功能存在差异，并且与广泛的单糖代谢有关。

单糖葡萄糖和果糖越来越多地用于西方饮食，其特点是食用高水平的加工食品、糖和脂肪。巧合地是，海藻糖作为一种用作食品添加剂的葡萄糖双糖，已经影响了一些人类毒性艰难梭状芽胞杆菌的出现。基于本研究的基因组分析，作者推断饮食中的葡萄糖或果糖可能通过艰难梭菌clade A或B分支的孢子对寄主的定殖产生不同的影响。因此，作者用葡萄糖、果糖或核糖补充小鼠的饮用水，并用A菌株或B菌株进行测试。核糖代谢基因未被阳性选择，故将该糖作为对照。当暴露于膳食葡萄糖（p=0.048）或果糖（p=0.0045）中时，受到clade A孢子感染的小鼠比clade B（图3b）表现出更高的细菌负荷。没有添加糖或添加了核糖（p=0.2709）的艰难梭菌clade A和B之间的细菌负荷没有差异（图3b）。

环境孢子密度有助于艰难梭菌在医疗环境中的感染性和传播。为了确定单糖利用率对孢子产生率的影响，作者评估了两个谱系单独或补充葡萄糖、果糖或核糖在基础限定培养基（BDM）中形成孢子的能力。虽然在添加了核糖（对照组）的艰难梭菌clade A和clade B中没有观察到差异（p=0.3095），但在添加了葡萄糖（p=0.0317）或果糖（p=0.0317）的情况下，艰难梭菌clade A菌株的孢子产量增加（图3c）。这些结果提供了实验验证，并与基因组的研究数据共同表明增加宿主定殖和通过食用单糖进行孢子介导的传播是艰难梭菌clade A类的一个特征，而不是clade B类。

最近出现的艰难梭菌作为一种重要的卫生保健病原菌，其主要原因是通过水平基因转移在运动元件上获得了抗生素抗性和碳水化合物代谢功能。这些最近的基因组适应发生在已建立的、独特的进化谱系，每个核心基因组表达独特的、预先存在的传播特性。本文揭示了一个新物种的不断形成，其生物学和表型特性与现代医疗系统中人类传播的传播周期一致（图3d）。

图3细菌形态的形成与宿主适应和传播能力的增强有关。

a. 艰难梭菌clade A的孢子比clade B的孢子更耐受广泛使用的过氧化氢消毒剂。

b. 与B类菌株相比，在单糖存在条件下，A类菌株的肠道定植增加。

c. 在单糖存在的情况下，Clade A菌株比B菌株产生更多的孢子。

d. 艰难梭菌A关键方面的表型适应性形成一个传播周期，增强了在人群中的传播。

本研究还报告了艰难梭菌clade A（027谱系和017谱系）在世界不同地区的医疗保健系统中流行的不同传播动力学和宿主流行病学，以及可能进入人类种群的078谱系。此外，在医疗保健系统中出现的艰难梭菌的广泛流行病学筛选也强调了艰难梭菌A族菌株的高丰度；它们代表了68.5%（美国）、74%（欧洲）和100%（中国大陆）的感染菌株。因此，作者报告了艰难梭菌属clade A物种形成、适应的生物学途径和流行病学模式之间的联系。总之，本研究阐明了细菌物种形成是如何通过现代人类饮食、获得抗生素耐药性或医疗制度加速的过程而产生和传播主要谱系的。

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