科研 | mBio ：利用盐度作为环境过滤因素将微生物结构与微生物性状分布和功能相互关联
本文由艾奥里亚编译，十九、江舜尧编辑。
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尽管土壤微生物在土壤生态循环中发挥着重要的作用，但仍缺乏将微生物过程与群落组成和结构联系起来的信息，这阻碍了将生态系统功能归于微生物群落特定成分的过程。微生物群落的结构和功能随环境的变化而变化；然而，两者的相互联系仍未完全清楚。本研究中，盐度被用作环境过滤变量，以探究其如何影响微生物性状分布、群落结构以及由此产生的土壤微生物的功能。本研究以非盐渍化土壤作为实验原料，通过添加不同浓度的NaCl，基于细菌生长和盐度之间的剂量响应关系，圈定靶标微生物群落性状（耐盐性）的分布情况，基于Illumina 16S rRNA基因扩增子序列分析细菌群落结构响应，基于呼吸以及细菌和真菌的生长情况探究微生物功能变化。结果发现，盐暴露很快会导致过滤特性的分布，而更强的过滤会导致更大的变化。过滤后的性状分布与群落组成差异有很好的相关性，表明性状分布的改变至少部分是由物种周转所驱动的。虽然盐暴露降低了呼吸，但微生物生长反应似乎具有竞争性相互作用的特点。当细菌生长在高盐度受到抑制时，真菌生长率最高，当细菌生长速率在中等盐度水平达到峰值时，真菌生长率最低。这些发现证实了非盐土中真菌对盐度耐受性的潜力比细菌更高。总之，基于盐度作为环境过滤因素，我们可以将目标性状分布与土壤微生物的群落结构和产生的功能联系起来。
论文ID
原名：Linking Microbial Community Structure to Trait Distributions and Functions Using Salinity as an Environmental Filter
译名：利用盐度作为环境过滤因素将微生物结构与微生物性状分布和功能相互关联
期刊：mBio
IF：6.747
发表时间：2019
通信作者：Kristin M. Rath，Arpita Maheshwari，Johannes Rousk
通信作者单位：瑞典隆德大学（Lund University）
实验设计
试验土壤样品采自瑞典南部草原表层土（0-15 cm），多个样点采集后进行混合，去除植物根部并过2.8 mm筛后备用。将250g土壤装在1 L的带密闭盖子的塑料容器中，通过添加不同量的NaCl（0，2，7和22 mg NaCl g-1土壤）以及每克土壤100 μL的水，将微环境设置为四个不同的盐度水平（作为“环境过滤因素”）。这些添加导致1：5的土壤-水浸提液表现出不同的电导率分别为0.1，1.1，2.8和6.8 dS m-1（表1）。每个处理制备两个重复，并向微环境中补充15 mg g-1土壤按照1：1的苜蓿-小麦秸秆混合物。在实验过程中（40天），土壤微环境在18 °C的黑暗中培养，培养温度与现场夏季土壤温度相当。分别在试验第1、2、3、5、7、10、15、20、26和40天，在每个微环境中测量呼吸（CO2产生）、细菌生长和真菌生长情况。此外，根据细菌生长对盐度的剂量-反应关系确定细菌耐盐性（目标群落特征分布）。由于亮氨酸含量较低导致的分析问题，第2天和第5天的细菌生长测量和群落耐受性测量在后续分析中被剔除。在实验结束后（第40天），对土壤样本进行微生物群落结构分析。
表1 四种不同盐处理的盐度信息。
结果
1 细菌耐盐性对土壤盐分变化的响应
细菌对盐的耐受性，以抑制50%的细菌生长的盐浓度（IC 50）做为指标，在第0天（图1B），实验开始时不同盐度梯度的初始值具有相似性，相当于悬浮液中的100到200 mM NaCl（图1B）。然而，在实验的前3天，细菌耐盐性的测定具有很高的变异性。从第10天开始，0和2 mg NaCl g-1处理的IC 50值明显低于7和22 mg NaCl g-1处理。0 mg NaCl g-1处理的IC 50在相当于100 mm NaCl的水平上下波动，而在2 mg NaCl g-1处理的IC 50在相当于200 mm NaCl的水平上下波动。7 mg NaCl g-1处理的IC50在第10天达到了相当于约300 mM NaCl的水平，此后保持不变。在22 mg NaCl g-1处理中，IC 50直到20天时才增加到约650 mM NaCl水平。总体而言，细菌耐盐性随着处理盐度的增加而增加（图1c）。
图1 A代表盐暴露第40天后盐浓度与细菌生长的剂量反应曲线；B代表在四种盐处理下细菌生长的耐盐性指数IC50；C代表从第10天起在不同盐度处理下细菌生长的耐盐性指数IC 50；所有数据采用平均值±标准差的形式表示。
2 细菌群落组成对土壤盐度变化的响应
在实验结束时，盐处理导致了不同处理之间群落组成存在显着差异（图2）。在基于Bray-Curtis差异的主坐标分析中（图2），四种不同的盐处理产生了不同的群落分布，在相同处理的重复中具有相似的群落组成。第一主坐标（PCo1）可能与群落耐盐性相关（图2）。在基于Bray-Curtis差异的排序中存在明显的arch效应。但在基于EMBAD的交替排序中，arch效应消失，第一排序轴占变异的96%。基于Mantel检验，细菌群落组成与群落耐盐性显著相关。在EMBAD中（ρ = 0.83，P < 0.01）所表现出的这种相关性比在Bray-Curtis中所表现出的群落组成差异（ρ = 0.61，P < 0.01）更显著。其丰度与群落耐盐性增加相关的分类群（Spearman`s ρ > 0.5）主要由Firmicute组成。在与群落耐盐性相关的17个可操作分类单元（OTUs）中，最大丰度为0.5%，其中9个属于Firmicute，其余包括Gammaproteobacteria，Actinobacteria，Bacteroidetes和Verrucommicrobia等细菌门。
3 微生物功能呼吸和生长对土壤盐度变化的响应
在0和2 mg NaCl g-1处理中，呼吸在实验的第一天达到最高，然后在接下来的40天中呈指数形式下降（图3A）。在第1天，0 mg NaCl g-1处理的呼吸比2 mg NaCl g-1处理的呼吸速率高，但随后这两个处理的呼吸速率收敛到相似的值。在7 mg NaCl g-1和22 mg NaCl g-1处理中，最初呼吸速率较低，随后分别在第2天和第3天达到最高的呼吸速率，之后呈指数下降。在实验结束时（第40天），22 mg NaCl g-1处理的呼吸速率低于其他处理。基于40天研究期间的累积呼吸值可以发现，累积呼吸随着盐度的增加而降低，从0 mg NaCl g-1处理中的大约6,000 μg CO2 g-1土壤到2 mg g-1处理中大约2,000 μg CO2 g-1土壤（图4A）。
0 mg和2 mg NaCl g-1处理下的细菌生长速率在第2天达到峰值，随后以指数下降（图3B）。在7 mg NaCl g-1处理中，其细菌生长率在第1天与0 mg NaCl g-1处理和2 mg NaCl g-1处理相似，但随后在第10天急剧增加。随后同样以指数趋势下降，在此期间，7 mg NaCl g-1处理的细菌生长率在整个实验的大部分时间内保持高于任何其他处理。在22 mg NaCl g-1处理中，在实验开始时细菌生长率接近于0（图3B）。22 mg NaCl g-1处理中的细菌增长率在前10天内略有恢复，但从未达到其他处理中的最大增长率。在第40天，所有处理的细菌生长率都表现出相似的情形。在40天研究期间的这些动态累计变化中，在7 mg NaCl g-1处理中的累积细菌生长远远高于任何其他处理，其累积生长率比0和2 mg NaCl g-1处理下的累积生长率增加了200%以上，而22 mg NaCl g-1处理下细菌的累积生长速率最低（图4B）。
与呼吸和细菌生长相比，真菌生长速率达到最大速率所需的时间更长（图3C）。在实验的大部分时间里，0和2 mg NaCl g-1处理的真菌生长速率相似。在前10天呈线性增加，随后呈指数下降。在第0天，7 mg NaCl g-1处理的真菌生长速率与0 mg NaCl g-1处理相似，但此后的增长速率较低。在第15天时，7 mg NaCl g-1处理下真菌生长速率达到最大值，它低于其他任何处理的最大真菌生长速率。在22 mg NaCl g-1处理中，真菌的生长速率最初接近于0，但随后它们迅速呈指数增长，直到第10天，随后呈指数下降。在第40天，0和2 mg NaCl g-1处理的真菌生长最高，而22 mg NaCl g-1处理下的真菌生长最低。基于40天研究期间的累积真菌生长值可以发现，在22 mg NaCl g-1处理中最高，在7 mg NaCl g-1处理中最低（图4C）。
讨论
1 利用土壤盐度作为群落特征分布和群落组成的过滤因素
基于假设，暴露在环境盐浓度梯度中过滤了目标群体的特征分布。盐暴露使所有添加盐处理的群落耐盐性增强（图1），并且耐盐水平随着群落接触盐量的增加而增加。盐暴露后的几天内，细菌对盐的耐受性开始增强，这表明微生物群落可以根据环境条件的变化迅速调整它们的功能特性分布。高盐浓度下的微生物群落适应需要更长的时间，即性状分布与环境之间的一致性是渐进的，对于更强的环境过滤浓度来说，稳定需要更长的时间。由于使群落耐盐性与环境盐度相一致的机制需要能量和碳源的合成或形成一个新的耐盐群落所需的资源，因此，在更强的资源限制下，诱导群落对盐的耐受性将发展得更慢。尽管低盐度（2 mg NaCl g-1）对呼吸和生长的影响相对较小，但该浓度下同样诱导群落耐盐性增强。这种性状分布的变化进一步伴随着细菌群落组成的变化（图2），说明单是原始群落的生理变化不足以解释群落的性状分布变化，群落演替起着重要的作用。
由于本试验所用的土壤没有盐接触史，与以前曾接触过高盐度的群落相比，最初的物种组成可能含有很少或根本不含耐盐的物种。本研究中开始的物种组成可能限制了群落所能达到的耐盐程度。此外，在自然系统中，扩散可以从周围区域吸引到更多的适应盐的物种，从而促进建立一个更耐盐的局部群落。到实验结束时，盐处理间细菌群落组成发生了明显且较大的差异，表明群落性状分布（耐盐性）的变化主要是由群落组成的变化引起的，即更加耐盐物种逐步替代了低耐盐的物种。在图2A中可观察到的明显的arch效应（一个潜在的线性梯度作为排序曲线出现），是当物种沿着环境梯度逐渐相互替代时在排序方法中常见的现象。此外，在研究的群落中，arch效应越大，差异就越大，这种现象强调了极端的群落差异，将实验盐度梯度的低端和高端分离开来，说明了物种更替是解释所观察到的性状分布变化的重要贡献机制。基于非饱和距离可以消除arch效应（图2c），使得盐度对细菌群落组成的主要影响更加明显。许多与群落耐盐性增强表现出正相关的细菌属于Firmicutes。除了包括几种嗜盐和耐盐菌株外，Firmicutes还包括许多能形成内孢子并能在极端环境中生存的物种，其中许多已知具有耐盐能力。这种能力将使Firmicutes在盐暴露的急性影响下生存下来，并在其他细菌死亡后变得更加丰富。
2 环境过滤因素对微生物功能的影响
加入底物后，呼吸的增加比细菌和真菌的生长更快（图3），说明添加底物的最初用于呼吸而不是进行生物合成。在7 mg NaCl g-1处理中，呼吸起效与生长起效之间的差异尤为明显（图3）。随着盐适应机制所需能源成本的增加，可将较少的底物分配给新生物质的合成。尽管真菌和细菌对盐处理生长的贡献不同，呼吸作用与真菌和细菌的相对重要性变化无关，而是直接与盐度有关。这些结果表明，在微生物群落中存在高度的功能冗余。然而，所有测量到的功能（真菌生长、细菌生长和呼吸）在暴露于高盐浓度后的前几天都受到严重抑制。关于细菌群落，只有当耐盐水平（图1）已被允许通过物种分类来适应新的环境时（图2），细菌开始恢复生长（大约在第7天，图1B和图3B）。特征分布的效应、群落组成的变化以及细菌群落的功能之间的这些联系表明，基于特性的方法可以使结构信息具有预测性。真菌虽然最初也受到了同样的影响，但从非盐渍土样本中提取的真菌群落比细菌恢复得更快（图3C）。这些模式表明真菌能更快地将它们的群落性状分布转移到一个新的环境中。
3 环境过滤因素对真菌对细菌相对重要性的影响
我们猜想，由于盐度对生长的抑制作用，细菌和真菌的生长都会随着盐度的增加而下降。然而，研究结果显示了一种对盐度更复杂的生长方式，这并不能证实我们的假设（图3-4）。细菌生长以7 mg NaCl g-1处理最高，22 mg NaCl g-1处理最低，真菌生长则表现出相反的趋势（图3-4）。真菌与细菌生长呈负相关关系，可能反映了细菌与真菌的竞争相互作用。已有报道表明，细菌的活性对真菌具有拮抗作用，在分解过程中，真菌和细菌相互竞争基质。因此，盐度对22 mg NaCl g-1处理中细菌生长的抑制可能会促进真菌的生长，因为真菌从与细菌的竞争中释放出来。相反，在7 mg NaCl g-1处理下，真菌生长可能被快速生长的细菌所抑制。在22 mg NaCl g-1处理中，来自非盐渍土的真菌群落在整个实验过程中可以生长，而与之对应的细菌则生长缓慢（图3和图4），这一事实证实了我们的假设，即真菌群落比细菌群落具有更高的耐盐能力。这与先前的研究结果一致，这些结果描述了一种最初不含盐的土壤中的各种微生物过程，结果发现，与受盐影响的细菌生长相比，真菌生长受到的抑制作用更小。真菌的几丁质细胞壁对低含水率造成的水分流失有较好的保护作用，并能提高真菌对高溶质浓度引起的低水势的抵抗力。细菌在7 mg NaCl g-1处理下生长较好，可能是在添加盐之前，土壤中存在的群落受到严重干扰后，快速生长的机会主义细菌占据主要地位，从而抑制了最初真菌的生长。在0和2mg NaCl g-1处理中，真菌和细菌生长均处于中等水平（图3-4），说明盐处理不会导致两组群落的破坏，因此不会导致真菌或细菌的竞争性释放。
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