理性阐述qPCR实验的Ct值的合理范围。（附Ct值过大或过小的解决方法）
在PCR的后期，扩增曲线不再呈现指数扩增，进入线性期和平台期。
3.Ct值的重现性
PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。
Ct值的范围？
1.扩增效率En
PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1个DNA分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。为了方便后续文章的分析，简要介绍下影响扩增效率的因素。
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影响因素 |
解释 |
如何判定？ |
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A.PCR抑制剂 |
1.模板RNA中可能含有抑制PCR反应的物质，如蛋白质或去污剂等。 2.反转录后的cDNA中含有高浓度的模板RNA和反转录试剂成分，也可能对后续PCR存在抑制。 |
1.可通过测定A260/A280和A260/A230比值或RNA电泳，判断是否存在污染。 2.反转录后cDNA是否按照一定比例进行稀释。 |
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B.引物设计不合理 |
引物不能有效退火 |
检查引物是否存在二聚体或发夹结构、存在错配；有时需注意跨内含子设计。 |
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C.反应程序不合适 |
1.引物不能有效退火。 2.DNA聚合酶活性未充分释放， 3.长期高温，DNA聚合酶活性下降。 |
1.退火温度高于引物Tm值。 2.预变性时间太短。 3.反应程序各阶段时间过长。 |
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D.试剂未充分混匀或移液误差 |
反应体系中，PCR反应成分的局部浓度过高或不均匀，导致PCR扩增不呈指数扩增。 |
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E.扩增子长度 |
扩增子长度太长，超过300bp，扩增效率低。 |
检查扩增子长度是否在80bp-300bp之间。 |
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F.qPCR试剂的影响 |
试剂中DNA聚合酶浓度较低或Buffer中离子浓度非最优化，导致Taq酶活力未达最强。 |
标准曲线测定引物扩增效率。 |
2.Ct值的范围
Ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。
对于不同的基因Ct范围，因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围。
3.Ct值的影响因素
由扩增循环数和产物量之间的关系：扩增产物量=起始模板量×（1+En）循环个数，可以看出，在理想条件下，起始模板量和En会对Ct值产生影响。模板质量或者扩增效率的差异会造成Ct值偏大或过小。
4.Ct值过大或过小
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问题 |
可能的原因 |
解决方法 |
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Ct值过大 |
1.模板浓度低或存在PCR抑制物 2.扩增效率低 |
1.提高模板浓度；或提高RNA或cDNA稀释比例；或重新制备模板。 2.降低退火温度，或选用二步法扩增；组分和体系充分混匀；优化反应程序；或尝试更换试剂。 |
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Ct值过小 |
1.模板浓度高 2.NTC和NRC存在污染 3.引物设计不合适 |
1.减少模板RNA量；或更高比例稀释cDNA。 2.重新更换所有试剂；或使用UDGase防污染试剂。 3.优化程序，避免非特性扩增。 |