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"文献解读"专题·第2篇
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原名：15N-amino sugar stable isotope probing (15N-SIP) to trace the assimilation of fertiliser-N by soil bacterial and fungal communities
译名：利用15N-氨基糖稳定同位素探针法(15N-SIP)示踪土壤细菌和真菌群落对肥料氮的同化作用
期刊：Soil Biology and Biochemistry
2019年影响因子：5.795
5年影响因子：6.767
在线发表：2019年9月
第一作者：Michaela K. Reay
通讯作者：Richard P. Evershed
第一单位：英国布里斯托大学化学学院
DOI: 10.1016/j.soilbio.2019.107599
Graphical abstract
虽然氨基糖是土壤有机氮(ON)的主要组成部分，但土壤细菌和真菌将硝酸盐(NO3-)和铵(NH4+)同化为氨基糖(As)是全球氮循环中被忽视的一个方面。更深入地了解氨基糖对氮肥添加的响应可能有助于提高农业系统内的氮素利用效率(NUE)。本研究的目标是扩展一种针对氨基酸(AAs)的敏感化合物特异性15N稳定同位素探针(SIP)方法，以研究无机N在一系列氨基糖(胞壁酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、甘露糖胺)中的固定。用15N-铵态氮和15N-硝态氮按农业相关用量(分别为190和100 kg N ha-1 的15NH4+和15NO3-)进行室内培养，获得32天内草原土壤氮同化到氨基糖库中的定量测定结果。利用气相色谱-燃烧-同位素比值质谱(GC-C-IRMS)发现，氨基糖各单体的δ15N值反映了施入的铵态氮和硝态氮的路径差异。通过测定15N并入特异性氨基糖的百分率，证明了细菌和真菌群落的N同化的不同动态变化。施用底物改变了细菌群落的氮同化动态，而真菌的氮素同化动态没有受到影响。施加的N底物进入细菌氨基糖库的速率和通量反映了已知的氨基糖的生物合成途径，由于周转率的不同，真菌氨基葡萄糖似乎比细菌氨基葡萄糖在生物合成上离应用底物更远。这种利用敏感和特异性的特定化合物氨基糖的15N-SIP方法，建立在现有氨基酸方法的基础上，能够区分微生物群落内氮素同化作用的动态变化，并利用与农业相关的施肥水平评估微生物的氮素利用效率(NUE)。土壤氨基糖（AS, Aminosugars）作为微生物残体标记物，具有稳定性和异源性。土壤中的氨基葡萄糖（GlcN，glucosamine）主要来自真菌，而胞壁酸（MurN，muramic acid）仅来源于细菌，在之前的推文【文献解读|土壤中真菌和细菌无机氮固定速率的计算】中已有介绍），在培养的土壤细菌中氨基葡萄糖(GlcNB)与胞壁酸(MurN)的质量比为5：1。土壤中的氨基半乳糖(GalN)和甘露糖胺(ManN)存在于真菌和细菌胞外聚合物(EPS)中，它们的作用还不完全清楚。基于氨基糖的稳定同位素探针技术（15N-AS-SIP）已被用于指示土壤中真菌和细菌无机氮的固定速率。气相色谱-质谱联用（GC-MS）可用于测定土壤氨基糖的含量，但由于GC-MS的同位素测定精度较低(±0.01原子%)，需要使用高15N富集和高底物施用量，这两者都会干扰系统并影响15N同位素辨别。气相色谱-燃烧-同位素比质谱法(GC-C-IRMS)具有很高的灵敏度，精确度为0.0002-0.0008 atom %，从而能够使用与农业相关的氮肥施用量和相对较低的15N富集(10 atom % 15N)。
本文将讨论土壤中最丰富的三种氨基糖(氨基葡萄糖GlcN、胞壁酸Murn和氨基半乳糖GalN)对不同N底物的细菌和真菌N同化动态的影响。将这些新的氨基糖N动态测定结果与同一实验中氨基酸库中的N动态进行比较，以全面评估两个土壤氮库中无机肥料的微生物N利用效率。
（一）土壤氨基糖含量的变化
土壤可水解总氨基糖的糖醇乙酯衍生物的典型气相色谱图如图1所示。虽然在培养期内个体氨基糖浓度发生了变化，如表1和表2所示，但在培养期内，每种氨基糖的相对贡献在两种处理中（添加铵态氮、硝态氮）都没有改变。
Fig. 1. Typical gaschromatogram of alditol acetate derivatives of total hydrolysable soil aminosugars. IS – myo-inositol internal standard and * - alditol acetate derivativeof glucose confirmed using GC-MS.
Table 1. Soil total N (TN; % dry weight) and composition of total hydrolysable amino sugars (THAS) pool for the 15N-NH4+-SIP experiment.
MurN, muramic acid; GlcNB, bacterial glucosamine; GlcNF,fungal glucosamine; ManN, mannosamine; GalN, galactosamine.
Table 2. Soil total N (TN; % dry weight) and composition of total hydrolysable amino sugars (THAS) pool for the 15N-NO3−-SIP experiment.
MurN, muramic acid; GlcNB, bacterial glucosamine; GlcNF,fungal glucosamine; ManN, mannosamine; GalN, galactosamine.
（二）氨基糖δ15N值变化趋势和定量评估
氨基糖δ15N值趋势和定量变化如图2和表3所示。图2中，氨基糖库中GlcN和MurN的δ15N值均在4天内迅速增加，然后缓慢增加或保持相对稳定。GalN的δ15N值在12h内波动，但随后恢复到初始值并保持相对稳定。表3总结了单种氨基糖的δ15N值的初始和总体变化率。在15NH4+处理中，δ15N值的初始变化率为MurN>GlcN，而δ15N值的总体变化率为MurN>GlcN>MurN。在最初的4天内，15NO3-处理的初始变化率正好相反，GlcN>MurN。同时用线性回归、非线性回归对Δ15N的初始变化率、总体变化率和并入平台百分比进行了拟合，并相互比较。
Fig. 2. δ15N values ofindividual amino sugars over the course of a 32-day incubation experimentfollowing addition of (a) 15NH4+ and (b) 15NO3−. Error bars are ± SE (n = 3).○ indicates δ15N values for MurN, ● is GlcN and ■ is GalN.
Table 3. Linear and non-linear regressions of Δ15N values of individual AS for the15NH4+ and 15NO3− treatment. A dash (-) indicates a horizontal line was a better fit than a linear regression (0–4days) or the non-linear regression did not fit the data (0–32 days).
（三）细菌和真菌氨基糖库中施用的15N并入趋势和定量评估细菌和真菌氨基糖库中施用的15N并入趋势和定量评估见图3、4和表4。图3显示了施入土壤中细菌(MurN和GlcNB)和真菌群落(GlcNF)的15N的总比例。细菌和真菌来源对GalN库的相对贡献还没有完全了解，因此GalN被排除在这些分析之外。细菌氨基糖库的15N并入量存在两个阶段，在培养4天内迅速增加，然后相对平稳的并入(图3)，而且GlcNB库的15N并入量高于MurN(图4)。真菌氨基糖库的15N并入量也有两个阶段，施用1d内快速增加，随后较慢的增长(图3)。同时用线性回归、非线性回归对Δ15N的初始变化率、总体变化率和并入平台百分比进行了拟合，并相互比较。
Fig. 3. Percentage of applied 15NH4+ (a)and 15NO3− (b) incorporated into thetotal hydrolysable amino sugar bacterial and fungal pools. The bacterial pool(●) is a summation of applied 15N incorporated into GlcNB and MurN whilst fungal pool (○) is GlcNF. Error bars are ± SE(n = 3).
Fig. 4. Percentage of applied 15NH4+ (a)and 15NO3− (b) incorporated into the individual bacterial amino sugar pools of GlcNB (●) and MurN (○). Error bars are ± SE (n = 3).Table 4. Results of linear (zero-order rateconstants k0) and non-linear first-order exponential assimilation (first order rate constant k1 and plateau P1) regressions of the percentage of applied 15N incorporated into individual AS. Units of k0 are % day-1 and units of k1 are day-1. A dash (-) indicates ahorizontal line was a better fit, or the selected non-linear regression did not fit the data set.
（四）15N-并入动力学反映的氨基糖生物合成途径
将与单种氨基糖吸收15N有关的15N-并入动力学与氨基糖的已知生物合成途径相结合，表明生物合成的邻近程度和流入库的通量(图5)。用于构建这些生物合成图谱的所有参数都基于15N并入氨基糖库的百分比，这解释了N的不同施用量。这些线条表示基于已知代谢途径的底物的生化连通性。盒面积与氨基糖(氨基糖)库中N的摩尔数成正比，与底物盒底物的垂直距离与初始掺入速率(K0)的倒数成正比，线宽与氨基糖中15N的平台率(P1)成正比。GalN线是虚线，因为无法确定此氨基糖的初始并入速率。15N并入单个氨基糖池的初始速率表明生物合成接近所应用的底物。所有氨基糖在生物合成上都更接近15NH4+处理，这与已知微生物对NH4+的偏好以及从THAA库（图6）中观察到的情况一致。生物合成邻近度的明显差异实际上反映了GlcN在真菌中的周转率低于细菌。与细菌群落相比，真菌群落更适合利用NO3-。
Fig. 5. Experimentally derived biosynthetic map using determined initial incorporation and fluxes of 15N from (a) 15NH4+ and (b) 15NO3− incubation experiments. The lines indicate biochemical connectivity of the substrates based on known metabolic pathways. Box area is proportional to moles of N inindividual amino sugar (AS) pools; vertical distance from base of substrate boxis proportional to the reciprocal of the initial rate of incorporation (k0) and line width is proportional to the plateau % incorporation of 15Ninto that AS (Pl). Note the GalN line is dashed as it was not possible to determine initial rate of incorporation for this AS.
当15N并入到平台期(表明施用的15N周转处于平衡状态，或固定在更多的顽固性库中)时，15NH4+和15NO3−处理的15N并入微生物池的百分比分别为14.6%(SE 1.4%)和2.49%(SE 0.4%)。在这个库中，进入氨基酸库的通量占两个处理吸收的15N的大部分，因为与氨基糖相比，氨基酸的比例更高。
Fig. 6. Percentage of applied 15NH4+ (a) and 15NO3− (b) incorporated into thetotal hydrolysable amino acid (AA) and amino sugar (AS) bacterial and fungalpools. Calculations for THAA are summations of the percentage of applied 15N incorporated into each AA (Charteris et al., 2016).The bacterial pool is a summation of applied 15N incorporated into GlcNB and MurN whilst fungal pool is GlcNF. Error bars are ± SE (n = 3).
(1)施用与环境有关的15N-化肥并没有改变氨基糖库的组成，但存在一种弱的激发效应。这与氮肥施用量的差异不成正比，表明其效果与氮肥的施用形式有关。(2)δ15N值表明，由于与NO3−同化相关的碳需求，以及真菌利用次生氮源的能力，两个处理之间15N的相对路径存在差异。(3)15N在单种氨基糖中的并入百分比使细菌和真菌的15N同化动态得以分离。在添加15N肥料后，15N同化动态最初以细菌群落相关的N通量主导(最多4天)，培养后期(最多32天)真菌群落的N通量逐渐显著升高。同化到单种氨基糖库中的15N也反映了已知的氨基糖生物合成途径，以及真菌库相对于细菌库的较慢周转。(4)微生物对NH4+的偏好反映在施用的15N并入氨基糖库中的通量较高，这是两种肥料施用量不同的原因。这些迄今不可用的N动态因子，结合氨基酸库的同化动态，可以用来评估不同N基质的微生物氮素利用效率NUE，并可利用微生物介导的土壤N循环的观点来指导土壤管理策略。
[1] Reay M K , Charteris A F , Jones D L , et al. 15N-amino sugar stableisotope probing (15N-SIP) to trace the AS similation of fertiliser-N by soil bacterial andfungal communities[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2019, 138:107599.[2] Charteris A F , Knowles T , Michaelides K , et al. Compound‐specificamino acid 15N stable isotope probing of nitrogen assimilation by the soilmicrobial biomass using gas chromatography/combustion/isotope ratio massspectrometry[J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2016, 30.
