记忆清除蛋白及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程和医学领域。更具体地，本发明涉及哺乳动物的记忆清除蛋白(hippyragranin)基因及其编码产物（专利名称），及其在促进记忆和遗忘等方面用途。此外，本发明还涉及含记忆清除蛋白基因及其蛋白的拮抗剂，以及含有上述物质的药物组合物和保健品。
学习和记忆是脑的基本功能。在高等动物，海马是内侧颞叶的一个脑结构，将之损毁后，新的记忆无法形成。海马的突触具有很强的可塑性。海马突触可被诱导产生及维持长时程增强(long-term potentiation，LTP)，与LTP诱导或维持环节相关的任意一种蛋白质的编码基因被剔除(knockout)后，海马就不再有LTP现象，并且动物也就不能形成记忆。因此，海马作为学习和记忆的重要结构，LTP作为学习记忆的突触机制，已被广大神经科学家所接受。
记忆和遗忘是一对孪生兄弟。记忆能力固然十分重要，然而遗忘也具有其存在的合理性和必要性。如果没有遗忘，人们将被各种各样记忆的信息所困扰，从而无法有效地应对现实生活。此外，虽然大脑的容量是极其巨大的，但是如果没有遗忘，那么大脑容量可能仍不足以存储一个人一生所接受的信息。此外，在某些情况下，例如对于某些痛苦的记忆，需要有将其遗忘的方法。然而目前还没有有效的促进记忆遗忘的方法。
总之，迄今为止对于参与或影响记忆的各种蛋白质还知之甚少。因此，本领域迫切需要发现新的与记忆有关的蛋白质，以及开发促进记忆或遗忘的药物。
因此，本发明的目的就是提供一种与记忆和遗忘有关的蛋白-记忆清除蛋白(hippyragranin)和编码序列，及其在改善遗忘方面的用途。
本发明的另一目的是提供记忆清除蛋白的拮抗剂，及其在抑制遗忘方面的用途。
本发明的另一目的是提供含有记忆清除蛋白、编码蛋白或拮抗剂的药物组合物和保健品。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的记忆清除蛋白多肽，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性(a)编码上述记忆清除蛋白多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组(a)具有SEQ ID NO1中29-523位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1920位的序列。
在本发明的第三方面，提供了一种含有上述的多核苷酸的载体，以及含所述载体的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种具有记忆清除蛋白活性的多肽的制备方法，该方法包含(a)在适合表达记忆清除蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有记忆清除蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面，提供了一种能与所述记忆清除蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的上述的记忆清除蛋白多肽、或上述多核苷酸，以及药学上可接受的载体。本发明还提供了一种保健品，它含有上述的记忆清除蛋白多肽、或上述多核苷酸。
在本发明的第七方面，提供了一种筛选促进或抑制遗忘的化合物的方法，它包括步骤(1)将记忆清除蛋白基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备表达记忆清除蛋白的细胞株(2)向步骤(1)中的表达记忆清除蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测记忆清除蛋白表达量的变化；促进记忆清除蛋白表达量增加的化合物就是促进遗忘的化合物，抑制记忆清除蛋白表达量增加的化合物就是抑制遗忘的化合物。
在本发明的第八方面，提供了一种判断个体记忆力的方法，它包括步骤检测该个体的记忆清除蛋白基因、转录本和/或蛋白的序列，并与正常的记忆清除蛋白基因、转录本和/或蛋白的序列相比较；存在序列差异就表明该个体的记忆力高于正常群体；或者或者检测个体的记忆清除蛋白转录本和/或蛋白的数量，并与正常水平的记忆清除蛋白转录本和/或蛋白的数量相比较；高于正常水平就表明该个体具有低于正常群体的记忆力，低于高于正常水平就表明该个体具有高于正常群体的记忆力。
较佳地，检测的是记忆清除蛋白基因或转录本，并与正常记忆清除蛋白核苷酸序列比较差异。
在本发明的第九方面，提供了一种促进遗忘的方法，包括步骤给需要遗忘的对象施用安全有效量的正常记忆清除蛋白。此外，还提供了一种抑制遗忘的方法，包括步骤给需要抑制遗忘的对象施用安全有效量的记忆清除蛋白的拮抗剂。一种典型的拮抗剂就是记忆清除蛋白基因(包括编码区和非编码区)的反义片段，其长度范围为10-1920bp或更长。
在本发明的第十方面，提供了一种检测个体记忆力水平的试剂盒，它包括特异性扩增记忆清除蛋白基因或转录本的引物，或者与记忆清除蛋白特异性结合的抗体。
在附图中，

图1A和1B分别是大鼠记忆清除蛋白cDNA序列和蛋白序列。
图2是大鼠记忆清除蛋白mRNA的表达谱。其中泳道1-8和M分别是1.海马；2.心；3.小肠；4.肾；5.肝；6.肺；7.骨骼肌；8.脾；以及M.分子量标准。
图3显示了成年大鼠中记忆清除蛋白基因的表达模式。
图4显示了在大鼠的LV区局部注射记忆清除蛋白基因反义序列核酸，可明显改善大鼠在水迷宫行为任务中的表现。其中，图4A显示了训练过程中大鼠找到平台所需要的时间，每组(每组12只)两天8次的平均值(mean±SEM)，图4B显示了各个训练阶段中大鼠找到平台成功次数的平均值(mean±SEM)，图4C是不同小鼠找到平台的俯视路线图，图中的“○”表示隐藏平台的所在位置。*，p＜0.05。
图5显示了在大鼠的CA1区局部注射记忆清除蛋白基因反义序列核酸，可明显改善大鼠在水迷宫行为任务中的表现。其中，图5A显示了训练过程中大鼠找到平台所需要的时间，每组(每组12只)两天8次的平均值(mean±SEM)，图5B显示了各个训练阶段中大鼠找到平台成功次数的平均值(mean±SEM)。*，p＜0.05。
图6显示了局部注射记忆清除蛋白的反义核酸基因后，显著增强大鼠的长时记忆。其中，图6A和6B分别显示了在CA1和LV区局部注射记忆清除蛋白反义核酸后，对场景恐惧的记忆情况。
本发明人经过广泛而深入的研究，不仅克隆了大鼠的记忆清除蛋白cDNA序列，而且还利用不同的动物行为学模型，对记忆清除蛋白基因在学习和记忆过程中的功能进行了研究。意外地发现，记忆清除蛋白与记忆遗忘有关。
本发明人利用差异表达筛选技术，通过筛选大鼠低表达基因亚库，获取了在去神经海马和正常海马中有差异表达的记忆清除蛋白。全序列测定包含记忆清除蛋白基因的克隆，发现其包含cDNA全长共1920bp，包括起始密码和PolyA。推定的记忆清除蛋白共包含165个氨基酸残基(图1A和1B)。同源性比较后得知，该基因为一个全新的基因。
对记忆清除蛋白基因在大鼠体内的表达模式进行了研究。RT-PCR结果显示，除了在海马中有表达外，记忆清除蛋白基因在许多别的组织中都有表达，如小肠、心、肾、脾和肺；在肝脏和肌肉中未能检测到记忆清除蛋白基因的表达。记忆清除蛋白基因在各种组织中的表达量并不一样，其在小肠中表达量最高，在肺中表达最弱，在海马、心、肾和脾中表达量比较接近(图2)。利用脑切片原位杂交技术，详细研究了记忆清除蛋白基因在成年大鼠脑内的具体分布，结果显示，记忆清除蛋白基因mRNA主要在海马中表达，另外在大脑皮层颗粒细胞存在极微弱表达，在脑的其它区域都未能检测到该基因的表达。在海马中，记忆清除蛋白基因mRNA表达区域仅局限在CA1、CA3和DG神经细胞层的神经元中(图3)。
以大鼠为实验动物，通过水迷宫(Water Maze)和场景恐惧(Fear-conditioningto Context)等行为学实验模型对记忆清除蛋白基因进行了功能检测。向海马CA1和LV区域定位注射记忆清除蛋白基因反义核酸，结果发现大鼠记忆清除蛋白基因的反义核酸可显著促进大鼠的学习和记忆能力(图4，5，和6)。
哺乳动物记忆清除蛋白的结构以及组织分布的特异性均提示，记忆清除蛋白在不同的哺乳动物中具有相同的功能，即可促进遗忘。因此人类的记忆清除蛋白同样与人的遗忘有关，根据记忆清除蛋白基因及其表达产物设计的药物和诊断治疗技术，可用于诊断和治疗人类的健忘症，并可改善记忆和提高运动协调能力。
如本文所用，术语“记忆清除蛋白”和“记忆清除蛋白多肽”可互换使用，指在哺乳动物的海马中特异性表达的、氨基酸序列与人、大鼠或小鼠的记忆清除蛋白氨基酸序列有70％以上，较佳地80％以上，更佳地90％，最佳地95％以上同源性的多肽。不同哺乳动物中的记忆清除蛋白可根据本发明公开的序列信息通过常规试验而获得。此外，记忆清除蛋白的活性片段、保守性多肽、或活性衍生物可用于本发明。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的记忆清除蛋白或多肽”是指记忆清除蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化记忆清除蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括记忆清除蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然记忆清除蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“记忆清除蛋白多肽”指具有记忆清除蛋白活性的SEQID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与记忆清除蛋白相同功能的、SEQ IDNO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括记忆清除蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与记忆清除蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗记忆清除蛋白多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含记忆清除蛋白多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了记忆清除蛋白多肽的可溶性片段。通常，该片段具有记忆清除蛋白多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供记忆清除蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然记忆清除蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。