Neurology病例：2型神经纤维瘤病的前庭神经鞘瘤

一位18岁的女性，有青少年白内障和听力障碍的病史，步态共济失调持续2年，双侧下肢锥体征阳性。

脑MRI（图）显示脑桥压迫桥小脑角外轴病变。

双侧前庭神经鞘瘤是2型神经纤维瘤病的病理诊断。此外，还有多个脊椎肿瘤也可以解释锥体束受损的症状。

图：脑磁共振成像

磁共振脑（A-C）显示双侧前庭神经鞘瘤（听神经瘤，箭头）压迫桥脑延髓区。这些轴外病变（箭头）在T1加权轴向图像（A）上呈低信号，在T2加权轴向图像（B）上呈高信号，且在钆给药后的T1加权图像（C）上显示增强。

NF2的估计出生率为1/25000。与神经纤维瘤病1型不同，这些患者没有广泛的皮肤表现。

阳性家族史以及青少年白内障和听力障碍的存在为早期神经影像学诊断提供了临床线索。

文献来源：

Nandhagopal, R., et al. (2010). "Teaching NeuroImages: vestibular schwannomas in neurofibromatosis type 2." Neurology 75(14): e60.

多发神经纤维瘤病(neurofibromatosis, NF) 是人类神经系统最常见遗传性疾病中的一种。自100年前由Von Recklinghausen首先描述以来, NF一直被认为是一种临床经过, 既影响外周又影响中枢神经系统。直到本世纪80年代后期, 应用分子遗传学的工具证实NF有两种不同的临床经过和遗传学特征, 故分为NF₁和MF₁。前者即为VonRecklinghausen病, 后者即为Ⅱ型神经纤维瘤病。

NF₁是一种严重的常染色体显性遗传性疾病, 发病率1/50 000, 外显率近95%(提示受累双亲的后代发生肿瘤的可能性约50%) 。受累的个体常在30岁左右发生双侧听神经瘤为其标志;此外,亦可发生其他颅神经和脊神经根的神经鞘瘤、脑膜瘤, 较少发生室管膜瘤和星形细胞瘤。

尽管NF₁非恶性, 但因肿瘤部位和多发性常致较高的早期病死率, 且发病年龄提前, 如听神经瘤、脑膜瘤的发病年龄较无遗传倾向者早。这些肿瘤可导致严重的神经系统症状尤其是耳聋、眩晕、步态不稳和偏瘫, 因此对NF₁患者作出早期诊断和早期治疗可有效地降低病死率和致残率。随着分子遗传学的发展, NF₁的发生主要与NF₁基因缺陷有关。

现已将NF₁基因定位于22q12,并认为NF₁基因为肿瘤抑制基因。自1993年NF₁基因由Rouleau等、Troffater等克隆以来, NF₁基因在中枢神经系统肿瘤中的作用倍受关注, 本文结合近年文献对NF₁基因研究进展加以综述。

一、NF₁基因的发现

1993年Rouleau、Troffater同时报道了NF₁基因的克隆,前者在D22S212和D22S32之间用位置克隆策略克隆出NF₁基因, 后者在D22S1和D22S26之间发现NF₁基因。NF₁基因的位点在22号染色体长臂12.2。

Rouleau从24个外显子粘粒中分离出100多个EcoRI片段。为了证实EcoRI片段含有几个CG二核苷酸簇 (常规标记基因5'端) , 检查每个片段含有2个CGs的抑制位点有几簇, 结果发现了至少含有3个不同抑制位点的有四簇;每个EcoRI片段又与啮齿类DNA杂交, 当发现它们有种系保守时, 用Northern印迹观察它们与人类多种细胞RNA转录的情况, 发现了一种为NF₁的候选基因 (SCH基因) , 又进一步从它们与猪、猴、小鼠、鸡、大田鼠DNA交叉杂交的种系保守序列中分离出2.0kbcDNA克隆-N1.1 (来自人胚脑cDNA文库) ;又用外显子粘粒DNA及22号染色体杂交细胞株进行Southern印迹, 反过来证明N1.1定位于这一区域;用N1.1cDNA southern分析检查了7个EcoRI片段, 这些EcoRI片段在相邻粘粒上的位置示基因跨距约100kb, 提示有许多大的内含子;在胎鼠脑及人肾、肺、乳腺、子宫、胎盘、成纤维细胞瘤中用Northern分析发现了4.5kb mRNA, 尽管它在其他组织中有广泛的表达, 但在胎脑中表达最高。

Troffatter认为22号染色体上NF₁基因的候选区域在D22S1和D22S28之间, 估计该区域在q12中含有6Mb, 对各种NF₁患者的淋巴细胞DNA用脉冲磁场凝胶印迹 (pulsed field gelblot) 探查候选区域不同的位点[包括D22S1、D22S15、D22S28、D22S32、D22S42、D22S46、D22S56、白血病抑制因子基因以及神经丝重链基因 (NEFH) ], 用Notl消化DNA, 发现NEFH探针在大部分的淋巴细胞株中有近600kb、400kb、230kb的片段, 并进一步发现230kb片段是400kb部分消化的产物。

为了cDNA克隆, 在28H6、96C10、121G10、123F5、101H11、7C4粘粒上应用外显子扩增即产生“外显子捕获” (trappde exons) 克隆, 每个外显子克隆代表了单个外显子或在捕获过程中多个外显子一起剪接, 共获得24个外显子, 其中6个与细胞骨架相关蛋白moesin、ezrin、radixin有相似的序列, cDNA筛选中获得最长的克隆是JJR-1、2256bp, 没有poly (A) 尾巴。

JJR-1含有一个开放的可读框1761bp、编码69kd蛋白, 在蛋氨酸上游80bp范围内有2个框内 (in-frame) 终止密码子 (stop condon) 。JJR-1cDNA跨距至少50kb, 其DNA序列与多种生物体 (包括人) moesin、ezrin基因有显著的相似性, 在蛋白水平亦与这些蛋白质非常相似, 因它与新的基因moesin、ezrin、radixin密切相关, 故命名它为merlin。

用培养的人肿瘤细胞株总RNA进行Northern印迹发现了2.6kb和7kb两种主要杂交种类, 在人各种组织如心、脑、肾、肺、骨骼肌、胰及肝的Poly (A) ⁺RNA中也检测到相似的类型, 这提示merlin基因可广泛地被表达。

二、NF₁基因及其蛋白

NF₁基因定位于22号染色体长臂一区二带 (q12) , 含17个外显子, 其转录产物为4.5kbmRNA, 编码一个含595个氨基酸的蛋白质, 分子量66kd (读框1785bp)或69kd (读框1761bp) , 命名为Schwannomin或merlin, 可能的起始位点在1～3的位置处。非翻译5'序列是144bp, 非翻译3'序列是135bp。

NF₁蛋白与moesin、ezrin、radixin及血红蛋白4.1等有高度的同源性, 整个蛋白与它们的相似率分别为48%、48%、47%和25%, N-末端相似率分别为62%、62%、62%和46%, 它们集中在起初的342个残基内, 即在N-末端含～200个氨基酸的同源区域内。该蛋白的二级结构含有一个球形N-末端区, 随其后的是α-螺旋区和高电荷的C-末端区, 后者在维持NF₁蛋白正常功能中起重要作用, NF₁蛋白中219/220周围的残基是其功能的关键部分。NF₁蛋白与moesin、ezrin、radixin (MER) 在N-末端和α-螺旋区有高度的相似性, 而在C-末端存在差异。

NF₁蛋白被认为是一种肌动蛋白相关蛋白, 在细胞骨架和细胞膜之间起连接作用。细胞骨架蛋白参与多种细胞活动, 包括决定和改变细胞形状、运动、分化、细胞-细胞间的信息交换、细胞内环境等。蛋白缺陷可影响这些过程并且影响细胞生长控制, 该蛋白的失活通过破坏细胞信息传递通路, 重新安排细胞循环调节或通过其他机制使细胞生长失控。

三、NF₁基因在相关肿瘤发生中的作用

肿瘤的发生是控制生长和分化的正常细胞发生基因突变的结果。根据基因对细胞生长、分化的影响分两类:对生长有正性影响的称原癌基因, 有负性影响的称肿瘤抑制基因。

原癌基因仅需1个拷贝基因突变成1个癌基因, 可引起基因过度表达的突变与蛋白产物的过度产生;而肿瘤抑制基因需要整个基因丢失或整基因突变才引起失活, 促进细胞生长和肿瘤形成, 从而引起修饰蛋白质不能产生且活性降低。通常情况下1个拷贝基因的失活不影响正常细胞生长控制, 肿瘤的产生需要2个拷贝基因的失活或一个拷贝基因失活伴有剩余拷贝功能的异常。

研究NF₁基因突变常用连锁分析、单链构象多态分析(SSCP) -PCR、DNA直接测序分析。连锁分析发现NF₁及相关肿瘤患者均有22号染色体长臂等位基因缺失 (LOH) , 此方法有助于将NF₁基因在染色体上的定位。后两种方法可直接检查发生突变的位点。

NF₁基因的失活主要通过基因缺失、插入和点突变 (无义突变—nonsense mutation、反义突变—dissense mutation) , 它们大多发生在编码蛋白的功能区:导致终止密码子移位、氨基酸取代、改变读框 (reading frame) 等, 引起蛋白切断 (truncated) , 蛋白功能丧失。

在NF₁相关肿瘤和NF₁病人中已揭示了NF₁基因的各种改变, 这些结果提示NF₁基因失活在相关肿瘤发生中的主要作用。在整个NF₁基因编码区(含内含子、外显子的交接处) 已出现了不同类型的突变, 迄今约发现了200多个突变, 如常见的缺失发生在1～136之间的碱基对,有的为单个碱基对缺失, 有的则多达100个碱基对缺失;在17个外显子中突变易发生在前面几个外显子 (1～13)。突变的大部分导致切断基因产物, 只有少数突变是反义的 (如A1613c,导致密码子538处脯氨酸代替谷氨酰胺;有的发生亮氨酸代替精氨酸、甲硫氨酸代替缬氨酸、酪氨酸取代天门冬氨酸等), 在200多个突变中只有13个是反义突变:其中7个体系突变包括F96、F62S、E106G、T35M、N220Y、L360P、L535P, 其余6个在肿瘤中发现L46R、K79G、V219M、R418C、I273F和K364I, 这些突变可能直接和NF₁肿瘤抑制基因的关键功能位点联系。突变的热点在密码子57处, 即由C变T。无义突变发生在密码子525和546处, 两者均引起了终止密码子移位即从595移到550。

NF₁基因对肿瘤起抑制作用, NF₁肿瘤发病机制符合“双击” (two hit) 模型, 即肿瘤抑制基因要经过2次突变才能导致肿瘤发生。在遗传性肿瘤中, 第一次突变发生在生殖细胞和机体所有正常细胞, 那么只需要再发生1次突变即可发生肿瘤;对于无遗传倾向的肿瘤, 2次突变必须发生在同一体细胞中, 由此分裂的细胞产生肿瘤。

对NF₁基因的研究有助于揭示某些肿瘤的遗传学特征, 现在听神经瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、乳腺癌、结肠肿瘤中均发现有NF₁基因的突变,这些突变大多引起蛋白质切断和失活。对NF₁家系可通过NF₁基因有关分子遗传学分析进一步确定其临床表型, 有助于早期诊断。然而NF₁各种表型和它潜在的基因型之间的关系有待于进一步探讨。

文献出处：

卞留贯,罗其中.Ⅱ型神经纤维瘤病抑制基因的研究进展[J].上海医学,1998(02):121-123.