【衡道丨干货】免疫组织化学技术操作中的优化和标准化
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免疫组织化学技术作为独立而重要的病理学检测指标，指导着病理诊断和临床个体治疗。它看似简单，却是较复杂的多步骤实验技术；实际的免疫组织化学技术操作中的优化和标准化，是非常重要的。
针对这一问题，也有很多病理科室作了系统的探讨和总结，包括标准操作以及质量控制等。今天就和小衡来看一看吧，以期与病理同仁们共同探讨学习。
1. 免疫组织化学染色前的标准化
1.1 固定：要求组织离体后立即固定，尽量不要超过 15 min，必须首选 4％甲醛。由于渗透力强，组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，能很大程度地提高免疫组织化学结果阳性率。固定液的量一般为组织块总体积的 5-10 倍，固定时间以 8-24 h 为宜，最长不超过 72 h；有研究显示，新鲜组织经 4％甲醛固定 72 h 后的标本，其组织抗原会不同程度地丢失，超过 1 周其组织抗原几乎不能被检出。
1.2 取材：理想取材 1.5 cm×1.5 cm×（0.2-0.3）cm，组织过大过厚都会造成脱水不彻底而产生抗原修复时的脱片现象。
1.3 切片：使用一次性切片刀，切片厚度为 2-4μm，淋巴结组织切片厚度 2μm；采用防脱玻片捞片，组织切片后应在 65-68 ℃恒温箱烤 2-3 h 防脱片，切忌高温或重复烘烤，以防止抗原扩散及丢失。
2. 抗原修复的标准化
众多固定液中在能保持组织细胞结构完整、抗原可测性上， 4％甲醛都是固定组织的首选。它能使组织中抗原决定簇封闭，也就是组织细胞经 4％甲醛溶液固定后导致抗原决定簇的封闭和交联，这可以通过抗原修复来修正。
为确保离体组织的抗原性，值得高度重视的是离体组织应由手术医师或病理医师配合科室立即固定。目前抗原修复主要有2种方法：酶消化法和热修复法。
2.1 酶消化法：
消化酶的作用在于能够暴露因组织固定而导致抗原决定簇的封闭，以增强染色效果。消化酶有多种，如胰酶、蛋白酶、胃蛋白酶等，但只有少数抗体可选择。
2.2 加热抗原修复法：
其机制是加热打开了组织抗原因 4％甲醛溶液固定引起的抗原决定簇的交联。加热修复法主要有：高压、微波和水浴等。
山西省运城市中心医院病理科就对这 3 种加热修复方法进行了比较。经高年资病理科主任医师进行阅片，他们得到的结论是——抗原修复的对照结果显示，高压锅好于水煮好于微波。
表一 10 例乳腺癌ER PR Her-2
采用高压锅 微波 水煮 3 种方法的比较
2.3 高压锅抗原修复的具体方法：
①将 1 500 - 2 000 mL 抗原修复液倒入高压锅内，加热煮沸；然后将置于耐高温塑料切片架上的脱蜡水化后的组织切片轻轻放入高压锅内，使组织切片位于液面下，盖紧锅，压阀并加热；盖子喷气计时 2.5 min，停止加热，将高压锅置于室温下 10 min 后再置于水龙头下冲 10 min，打开高压锅盖。
②将修复液倒入不锈钢杯中，再将置于耐高温塑料切片架上的脱蜡水化后的组织切片轻轻放入不锈钢杯内；直接将不锈钢杯放入内有蒸馏水的高压锅内，盖紧锅，压阀并加热；盖子喷气计时 3 min，停止加热，水冲取出不锈钢杯，置凉再取出切片。
山西省运城市中心医院病理科选用了不同来源组织，比较了采用 2 种不同方法时的脱片情况，见下表。他们的结论是，切片放入不锈钢杯中再放入高压锅中的脱片现象几乎没有，这种方式更安全。
2.4 抗原修复液的选择：
加热抗原缓冲修复液有多种，如柠檬酸盐修复液（pH 6.0）、Tris修复液（pH 7.0 - 8.0）、乙二胺四乙酸（EDTA）修复液（pH 8.0 - 9.0）等。目前没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，不同的抗原对修复液的依赖也不一样。
3 种修复液方法的比较可见下表，同时，核染色阳性的抗原用 pH 9.0 的 EDTA 修复液效果好，胞质胞膜染色阳性的抗原用 pH 8.0 的 EDTA 修复液的效果好。
3. 免疫组织化学染色的标准化
3.1 试剂：免疫组织化学实验检测方法多种多样，抗体的厂家和种类较多，商业化试剂也越来越简便、高效与快捷。建议选购有信誉、质量管理体系完善、产品质量有保证且有良好售后服务的著名厂商的试剂；每次购入免疫组织化学试剂时，需要配合以前使用过的有效的试剂进行染色。
3.2 抗体：推荐使用即用型抗体，按厂家操作条件染色。对于一次用不完的抗体可保存在 4 ℃冰箱内，而不要放在冷冻室反复冻融，抗体效价会急剧下降而失效。
3.3 磷酸盐缓冲液（PBS）：用 pH 7.4 - 7.6 的缓冲液再配 3‰的吐温 20 效果极佳，吐温 20 不但能清洗片子而且能使加入的抗体平铺开，画圈效果更好，防止边缘效应。
3.4 检测系统：推荐采用非生物素型聚合物检测系统。
3.5 免疫组织化学染色操作步骤：免疫组织化学染色方法分手工和机器操作。
全自动免疫组织化学染色仪，可依据不同抗原修复，可依据不同抗原设立不同时间，独立温控，可重复性强。其操作标准、规范，对免疫组织化学染色的现代化和标准化起到了巨大的推动作用，既节约了人力又大大减少了人工操作的误差，推荐使用全自动免疫组织化学仪。
3.6 染色结果判读：首先看阴阳性对照，当然有的组织也有内对照，也是我们参考的条件之一；再就是看阳性部位是否正确，结合苏木精-伊红（HE）切片定位。要求病理医师从同一张免疫组织化学切片上得到相同的病理诊断结果。
后记
小衡有注意到，在衡道医学消化道病理交流群中，有老师的片子被大家称为“漂亮，染色确实好”、“不仅是单纯染色好，切片包埋功夫也了得”、“制片步骤几乎完美”。想必大家对染色步骤中的时间控制，以及其他染色经验很是感兴趣。我们期待着经验大师们对此有细致地分享。
还有一点小衡也想说一说，免疫组织化学不仅是一项经验性技术，同时也有一定的特异性。比如不同批次试剂的批间差异、不同品牌仪器实际效能的差异和同一仪器自身随着使用年限发生的损耗等，这些容易被忽视的因素都会对实验过程产生细微的影响。所以，在经验基础上结合科室自身实际情况也是很有必要的。
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