人乳头瘤病毒核酸检测及基因分型试剂盒
人乳头瘤病毒核酸检测及基因分型试剂盒（PCR-反向点杂交法）说明书
【产品名称】
通用名称：人乳头瘤病毒核酸检测及基因分型试剂盒（PCR-反向点杂交法）
【包装规格】
作I者：疾控科研试剂博客
联I系：I99I-4747-I94
单管单人份，24人份/盒。
【预期用途】
本试剂盒适用于定性检测人宫颈脱落细胞样本和生殖泌尿道分泌物中 28 种人乳头瘤病毒(HPV)基因型别的核酸，包括：
15 种常见高风险HPV 型别：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68，82；
3 种少见高风险HPV 型别：26，53，73；
10 种低风险HPV 型别：6，11，40，42，43，44，54，61，81，83。
由于未做相关验证，本产品不能用于宫颈癌筛查相关用途。
本试剂盒检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据。
【检验原理】
本试剂盒针对人乳头瘤病毒基因组 L1 区设计特异性引物和探针，同时以β-globin 为参比基因设计引物探针，并将特异性探针包被在醋酸纤维膜的不同区域制备型特异性识别膜条。通过生物素标记的引物进行靶片断扩增，扩增产物和膜条上的型特异性探针进行液相杂交，杂交反应结束后经过洗涤确保靶标中的特异性片断和特异性探针结合；最后通过生物素-链霉亲和素反应系统进行显色反应，对显色结果进行分析，从而对样本中的 28 种人乳头瘤病毒进行 DNA 分型。
【主要组成成分】
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组分名称 |
规格 |
数量 |
主要组成成分 |
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细胞裂解液 |
1200µl/管 |
1 |
Tris-HCl |
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HPV 分型 PCR 试剂 |
特异性引物（上游引物为 5’生物 |
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HPV 分型 PCR 反应管 |
单管单人份 |
24 |
素标记）、Taq 酶、UDG 酶、固体 |
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封盖剂（石蜡）、PCR buffer |
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HPV 阳性质控品 |
100µl/管 |
1 |
HPV18 型感染的 Hela 细胞 |
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阴性质控品 |
100µl/管 |
1 |
纯化水 |
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杂交液Ⅰ浓缩液 |
50ml/瓶 |
1 |
SDS，SSC |
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杂交液Ⅱ浓缩液 |
50ml/瓶 |
2 |
SDS，SSC |
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溶液Ⅰ |
200µl/管 |
1 |
链霉抗生物素蛋白(POD) |
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反向点杂交试剂 |
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溶液Ⅱ浓缩液 |
50ml/瓶 |
1 |
柠檬酸钠 |
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溶液Ⅲ |
10ml/瓶 |
1 |
TMB |
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溶液Ⅳ浓缩液 |
100µl/管 |
1 |
过氧化氢 |
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尼龙膜，探针（包括 CC 点探针、PC |
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HPV 分型杂交膜条 |
24 人份/袋 |
1 |
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点探针和 HPV 型别特异性探针） |
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注：1. 需要自备的试剂：无菌生理盐水，纯化水等。 |
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2. 不同批号试剂盒的以上成分不可以互换使用。
3. 可使用本试剂盒自带细胞裂解液进行核酸提取，也可使用商品化的核酸提取试剂盒：广州和实生物技术有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（备案号：粤穗械备 20140038 号）。
4. 本试剂盒组分不包含配套的样本采集设备。
【储存条件及有效期】
储存条件：HPV分型 PCR 试剂保存于-20±5℃，避免反复冻融；反向点杂交试剂保存于 2-8℃。有效期 9 个月。运输采用干冰（或者冰袋）保持低温，72 小时内不影响本试剂盒的检测性能。
试剂使用时开瓶（复融）8 小时内其检测性能不受影响。试剂使用前反复冻融次数不应超过 4 次。
生产日期：详见产品标签。
【适用仪器】
ABI 9700 型 PCR 仪，上海精宏 DKZ-2 型电热恒温振荡水槽，爱普生 J232A 扫描仪，达安膜条斑点识别分析系统。
【样本要求】
1
1. 适用样本类型：宫颈脱落细胞，生殖泌尿道分泌物。
2. 受检需知：
月经正常妇女，在月经来潮后 10～18 天为最佳检查时间；检查前3 天内不应使用阴道内药物或做阴道冲洗；检查前 24 小时内不应有性行为。
3. 样本采集：
宫颈脱落细胞样本：医护人员先用窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用宫颈刷置于宫颈口，顺时针旋转 4－6 周以获取足量的上皮细胞，然后取出宫颈刷置于盛有 2ml 生理盐水的无菌小试管中备检。若样本黏液过多或者含血量过多应该尽量重新取样。
女性生殖泌尿道分泌物样本：首先使用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用棉拭子插入尿道约 2CM，然后捻动棉拭子，最后将棉拭子放入细胞保存液中，密闭送检。采集尿道样本时，受检者必须在采集前 2 个小时禁止小便。
男性生殖泌尿道分泌物样本：使用细小的尿道棉拭子，插入男性尿道 2-4CM，然后捻动尿道棉拭子取出分泌物，最后将尿道棉拭子放入细胞保存液中，密闭送检。
4. 样本保存和运送：通常情况下，宫颈脱落细胞样本采集后置于生理盐水的无菌小试管中，生殖泌尿道分泌物样本采集后置于细胞保存液中，均可立即用于测试。如需保存，置于 2-8℃保存不应超过两周，-20±5℃保存不应超过一年。样本运送时应采用 0℃冰壶。
注：样本采集及保存中使用的宫颈刷和细胞保存液，推荐使用江苏健友医疗科技有限公司生产的一次性使用无菌宫颈采样器和细胞保存液。
【检验方法】
1.样本处理和核酸提取（样本处理区）
本试剂盒中的阴性质控品参与提取，用于对环境进行监控；HPV 阳性质控品参与提取，用于 PCR 检测试剂的质控。
可采用广州和实生物技术有限公司生产的核酸提取试剂盒（核酸提取或纯化试剂：粤穗械备 20140038 号），具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。也可采用本试剂盒自带细胞裂解液进行核酸提取，该提取试剂含有颜色示踪剂，能指示模板加入与否。具体操作如下：
1.1振荡宫颈刷保存管或棉拭子保存管 10-30 秒，使细胞充分落入液体，取振荡后液体 0.5ml-1.0ml（如果细胞数量少可以加大体积到 1.5ml）转至 1.5ml 离心管中；
1.2 10,000rpm 离心 3 分钟，弃上清；
1.3 样品沉淀中加入 1ml 无菌生理盐水，洗涤沉淀，10,000rpm 离心 3 分钟，弃上清；
1.4 样品沉淀中加入 50µl 细胞裂解液，振荡 60 秒，充分悬浮细胞沉淀，备用；