筛选稳定表达Cas9蛋白的细胞株构建技术原理

　　一、试剂

　　1.细胞培养基及其他细胞培养所需试剂。

　　2.转染辅助试剂Polybrene（用水配制为6mg/ml，-20℃冻存）。

　　3.Cas9表达慢病毒（制备方法见Cas9慢病毒包装实验）。

　　4.嘌呤霉素或者G418。

　　二、实验步骤

　　1、转染前24小时将293T以适当密度铺板到12孔板。感染病毒时细胞密度在80%左右。

　　2、取出制备好的Cas9表达慢病毒（pLV-Cas9-Puro包装得到，制备方法见Cas9慢病毒包装实验），室温融化。按照下面的方法准备慢病毒感染液：

　　以感染1个12孔板细胞（细胞培养基体积1ml）为例

　　病毒液 50ul

　　细胞完全培养基到950ul

　　加入Polybrene到终浓度为6ug/ml

　　3、用病毒感染液替换原细胞培养基，继续培养24小时。用新鲜的培养基替换病毒感染液。

　　4、病毒感染48小时后，转入的基因开始表达。这时可以加入嘌呤霉素至终浓度为3ug/ml。

　　5、在筛选过程中为维持抗生素合适的浓度和细胞营养，每隔2-3天应该换液一次，去除死细胞，补加抗生素。

　　6、大约6-7天，细胞不再死亡。扩大培养筛选得到的细胞，进行检测。

　　三、PCR检测细胞基因组中的Cas9基因

　　用基因组PCR检测293T-Cas9细胞中的Cas9基因。

　　鉴定引物：

　　Cas9-F：ACAGTCTTCACGAGCACATC

　　Cas9-R：TCCTCTTCATCCTTTCCCTA

　　产物大小198bp

　　步骤：

　　1、分别提取293T-Cas9细胞和293T细胞的基因组DNA。

　　2、PCR扩增

　　反应体系：

　　2×Taq Mix 25ul

　　Cas9-F（10uM）2ul

　　Cas9-R（10uM）2ul

　　基因组模板 5ul

　　加水补足50ul

　　反应条件：95℃ 预变性5min；95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，35个循环。

　　3、电泳检测PCR产物

　　M：DL2000 DNA marker

　　1：293T-Cas9扩增产物

　　2：293T扩增产物

　　四、 相关实验

　　Cas9表达慢病毒包装

　　用pTYNE载体验证Cas9过表达细胞系

　　五、 相关产品

　　Cas9稳定表达细胞系