单细胞测序揭示皮肤伤口中成纤维细胞的异质性
不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了,很幸运聚集了五个小伙伴携手共进,我们承诺不间断更新5个月,把我们这两年的学习成果全部掏出来给大家,包括5个栏目:
文献速递(简短介绍,扩充知识面)
文献详解(图文并茂带来大家系统性学习)
R与Bioconductor的技巧(书籍翻译,妙招共享)
scRNAseq的GitHub的书籍翻译(原汁原味的名校教程)
全网第一个单细胞转录组视频教程学习笔记分享
现在你看到的是文献速递
希望大家能有所收获!
文章主要对小鼠背部皮肤伤口中的细胞进行单细胞测序(10X Genomics),对其中的fibroblast进行分群,发现其中一群fibroblast表达hematopoietic markers。对其进行单细胞western blot和单细胞全长测序(Fluidigm公司的C1™)分析以及一些生物学实验验证,发现hematopoietic lineage cells 可以分化成一部分的myofibroblast。
单细胞测
测序数据介绍
工具: 10X Genomics
测序对象: 对12只Sm22-Cre;tdTomato小鼠皮肤进行全层伤口造模12天(PW12)后,取其伤口内组织,消化成单细胞,进行单细胞测序。对通过质控的21819个细胞进行分析。
测序数据:GSE113854
细胞分群分析
使用Seurat 包进行聚类分析,分出13个群,根据可能的marker,对不同类细胞进行定性。
比对:mm10 reference genome (GRCm38.91) using Cell Ranger Version 2.1.0
细胞过滤: 初始测得~22,322个细胞,最后保留的细胞: < 8000 UMI/cell 和< 2500 genes/cell, 线粒体基因表达不多于 8% ,质控后得~21,819个细胞进行下游分析
聚类分析:使用Seruat R包进行聚类分析。表达矩阵→归一化→PCA分析,挑选高变化表达的基因,expression>0.01, dispersion >1.0 → Jackstraw method挑选top40 principle component。
做聚类分析 The top 40 PCs were used for clustering with the Louvain modularity-based community detection algorithm to generate cell clusters (FindClusters function, 13 clusters with resolution = 0.45).
确定marker gene:不同类别之间p<0.01,log(FC)>0.25 →t-SNE分析。 对伤口中的fibroblast细胞进行再分群也是类似的方法。
其他分析
细胞周期分析
通过参考文献,确定43个G1/S期和54 G2/M期标志基因【Ref29】。使用Seurat中的CellCycleScoring函数来计算。同时用which.cells 进行定量
Pseudotime analyses伪时间分析
通过已知的fibroblast marker gene来进一步分群,用Monocle 2 来推断伪时间轨迹,再进行参考文献中的scEpath【Ref33】方法来确定伪时间依赖的gene表达变化。
RNA velocity analyses
主要分群情况
先将全部细胞分为13个群,其中的C1,C2,C4,C6,C9是fibroblast,
再将其中的fibroblast根据分为12个群
全长单细胞RNA测序
测序数据
工具:使用Fluidigm公司的C1™单细胞全自动制备系统来捕获单细胞并进行单细胞裂解、反转录,使用 Qubit 2.0测量cDNA浓度,≥1.0g可被用于下一步文库构建。
对象:对2-3只Sm22-Cre;tdTomato小鼠皮肤进行全层伤口造模后12天,15天,21天后,取其伤口内组织,消化成单细胞,通过FACS分选进行分选。
数据:GSE113605
备注:这个C1单细胞自动制备系统可同时捕获96个的细胞,在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程。做这个实验是为了确定表达血细胞marker的fibroblast在伤口后的12,15,21天是否一直存在。用这个方法比较省钱快速。
数据分析
比对和量化
比对:Bowtie(vesion 1.0.0)比对到鼠的基因组(mm10/gencode.Mv13) :rsem-prepare-reference –bowtie –gtf
量化:Expectation-Maximization algorithm (RSEM) (version 1.2.31) : rsem-calculate-expression -p $CORES –paired-end.
Samples displaying ≥ 159,000 aligned reads 被用于下游分析
质控
基因表达>11,000,线粒体基因counts大于15%,基因表达<3个细胞的全部除去,总共56个细胞被去除,留下总共288个细胞(PW12,116个细胞;PW15,100个细胞;PW21,72个细胞),进行下游分析。 使用SCnorm归一化。
意义
前人的研究中,成年小鼠皮肤造模大伤口(>1cm2)后,能够再生毛囊,小伤口(<1cm2)则没有此能力。对于其中的机制,目前认为经典的WNT信号通路在毛囊再生过程中起主要作用。随着单细胞测序的热度见长,目前单细胞测序也被应用在此领域研究,可用来了解伤口中细胞的成分和小分子,并探究哪些组分在其中其重要作用。