【海普周报】深度解析DNA损伤修复（DDR）通路
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第
30
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>>>DNA损伤修复（DDR）通路：
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除部分微生物外，生物体最重要的遗传物质是DNA，DNA的完整性影响着生物体遗传信息传递的准确性。在人机体内，时常存在DNA损伤（DNA Damage）。内源因子（例如，复制错误、氧化脱氨和活性氧物质）和外源因子（例如UV光和辐射）可引起DNA化学结构或编码特性出现异常，从而形成DNA损伤，进而对基因组的复制和转录造成影响。如果DNA损伤得不到及时修复，细胞将经历细胞周期停滞，衰老或程序性细胞死亡，就会对机体造成威胁，甚至会导致疾病的发生，如肿瘤发生过程中DNA修复功能会发生缺陷并破坏基因组的稳定性。在正常情况下，人体具备修复DNA损伤的能力，即DNA修复（DNA Repair） 。
目前部分肿瘤患者也是通过该机制利用DNA损伤药物来进行治疗的，如许多化疗药物和放射治疗的机制是破坏肿瘤细胞DNA；有的靶向治疗药物（PARP抑制剂）通过修复DNA功能缺陷来产生合成致死效应。（注：合成致死是当两个基因分别发生突变时仍保持细胞活力，但当它们的功能同时受到抑制时会导致细胞死亡）
DNA修复过程涉及4个步骤：
（1）识别（Recognition），DNA损伤的鉴定；
（2）剪切（Removal）；
（3）再合成（Resynthesis）；
（4）修复（Restoration）。
当DNA出现损伤时，损伤位点会被识别并可修复，然后受损的碱基被移除，损伤位点经过加工后准备接受新的碱基，紧随其后的是再合成，产生新的核苷酸补位，最后重建DNA螺旋结构。其中一些蛋白/酶参与其中（见图1），共同构建了这种有效的保护机制，在维护遗传信息稳定性的同时，保证了遗传物质的保护和留存。
图1 参与DNA修复的蛋白类别
因此，在面对人类健康重大威胁之一的肿瘤，理解DNA修复的分子机制、癌症如何逐渐改变DNA的修复过程以及如何利用这些过程杀死癌细胞显得尤为重要。
DNA修复过程涉及很多条通路，我们统称为DNA损伤修复系统（DNA Damage Response or DNA Damage Repair, DDR）通路（见图2）。这些通路之间存在交互作用，参与这些通路的许多蛋白质直接或间接影响其他的DNA修复通路，DNA修复蛋白通常的作用机制并不明确，而且在肿瘤发生时可以变更。
图2 DNA损伤中涉及的细胞信号传导通路及该通路中具有治疗可操作性的特定靶点
DDR系统包括八个通路：
（1）错配修复通路（Mismatch Repair，MMR）；
（2）碱基切除修复（Base Excision Repair，BER）；
（3）核苷酸剪切修复通路（ Nucleotide Excision Repair，NER）；
（4）同源重组修复通路（Homologous Recombination Repair，HRR）；
（5）非同源末端连接通路（ Nonho-mologous End-joining，NHEJ）；
（6）检查点因子（Check Point Factors，CPF）；
（7）范可尼贫血机制（Fanconi Anemia，FA）；
（8）DNA跨损伤复制（Translesion Synthesis，TLS）。
其中非同源末端连接通路（NHEJ）和同源重组修复通路（HRR）都是修复DNA双链断裂（DSB）的，当检测到DSB时，哪条通路被激活取决于许多因素，如细胞周期阶段进展、DNA损伤信号通路和检查点激活、修复难度水平、受损的DNA结构端等。DDR系统中几个重要的通路（MMR、BER、NER、HRR、NHEJ）gene list 和相关介绍可见图3~7.
图3~7 DDR系统中几个重要的通路（MMR、BER、NER、HRR、NHEJ）gene list 和相关介绍
DDR系统对于保持基因组完整性至关重要，因此，该系统中的突变可能诱导超突变表型。既往研究表明，两种特殊性质的DDR途径 [MMH（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）和BER（POLE）] 的基因缺陷导致了ICB（免疫检查点阻断）的持久临床效益。患有ICB的黑色素瘤患者通常在HRR途径中的主要基因BRCA2中携带突变。
另一项研究（Teo MY, et al. 2018）显示，参与DDR通路的34个基因的有害改变，其患者表现出较高的TMB水平，并改善了尿路上皮癌中ICB治疗的临床结果。然而，参与这些研究的DDR基因数量是有限的，并且大多数其他DDR基因研究很少。此外，由于不同DDR途径之间的相互作用，应检查不同DDR通路对TMB的贡献权重，但迄今为止还没有很好地建立。
在上一期我们提到基于T细胞的癌症免疫检查点抑制剂疗法，临床工作者提出并研究了肿瘤PD-L1表达、突变率和肿瘤新抗原负荷等生物标志物来预测免疫抑制剂的临床获益，但这些生物标志物在患者分层上并不绝对，不能绝对的将ICB治疗获益和不获益患者区分开，因此探寻ICB治疗的预测性标志物有助于精准筛选ICB获益人群或是免疫治疗人群的精准分层。
2018年11月15日，来自中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤内科分子肿瘤学国家重点实验室的王洁教授团队，在Cancer Research上发表了关于DDR通路指导免疫治疗的研究。该团队回顾性地利用数据库（如TCGA、ICGC）的多组学数据（WGS/WES/RNAseq/Neoantigen）和临床研究中的临床疗效（ORR/DCB/PFS/OS）（见表1）数据，分析了DDR通路中的基因突变与TMB、NAL（新抗原负荷）和免疫治疗疗效预测的关系。
表1 中国医学科学院王洁教授团队研究的数据源
研究团队将：
（1）DDR通路突变被定义为DDR通路的基因中其基因编码区域的任何非同义突变，包括错义突变、无义突变、插入/缺失和剪接突变；
（2）co-mut （共突变）被定义为HRR-BER或HRR-MMR通路基因出现联合突变；
（3）TMB高低评判：TMB计算纳入基因编码区域中所有体系非同义突变；基于四分位法将TMB或NAL划分为高或低，其数值中偏大的四分之一部分被定义为高；
（4）≥50%的肿瘤细胞表达PD-L1，则被定义为PD-L1 。
研究发现：
（1）DDR通路中的基因共突变是TMB评估的较优替代
- 相较于DDR野生型患者，在一条或多条DDR通路中存在突变的患者其TMB和NAL均显著较高。
- 随着DDR通路基因突变的数量增加，TMB和NAL显著增加。对于TCGA中的TMB、ICGC中的TMB和TCGA中的NAL，其Spearman相关系数分别为0.66、0.68和0.59。
- 单一DDR通路基因突变可能不能解释TMB-H。
- 不同DDR通路之间存在潜在相互作用，具有HRR-BER或HRR-MMR基因共突变的患者比其他DDR通路共突变的患者显示出更高的TMB和NAL。
- co-mut 的发生率在不同的癌症类型中是不同的（见图8）。
- co-mut 与MSI-H显着相关（P<0.0001）（见图9）。在MSI-H频率较高的肿瘤如结直肠腺癌、胃腺癌和子宫内膜癌中，大多数MSI-H样本是共突变的，且co-mut 覆盖了比MSI-H更多的癌症类型。在co-mut /MSS组 和 co-mut—/MSI-H 组之间未观察到TMB的显著差异（见图9）。
图8 不同肿瘤类型中co-mut 的频率
图9
左图：co-mut 或MSI-H患者的比例；
右图：不同的共突变和MSI状态组合中肿瘤突变负荷的比较
（2）co-mut 与免疫调节因子的mRNA表达具有相关性
研究团队采用GSEA方法分析了co-mutation与免疫调节因子的关系。结果显示：与co-mut-相比，co-mut 的患者其免疫调节因子显示出更高的mRNA表达水平，这些免疫因子包括免疫检查点（PD-L1和LAG3）、肿瘤免疫微环境（IL1B，IL6和PTGS2）、 T效应因子和IFNγ相关特征（INFG，CXCL9，CXCL10，CXCL11，EOMES，GZMB，GBP1和STAT1）和T细胞受体相关基因（CD8A，CD3G，CD3D，IKZF3和TIGIT）。提示co-mut 患者可能具有更高的免疫原性，对免疫治疗更敏感。
注：基因集富集分析 （Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）的基本思想是使用预定义的基因集，通常来自功能注释或先前实验的结果，将基因按照在两类样本中的差异表达程度排序，然后检验预先设定的基因集合是否在这个排序表的顶端或者底端富集，基因集合富集分析检测基因集合而不是单个基因的表达变化，因此可以包含这些细微的表达变化，预期得到更为理想的结果。
（3）co-mut 状态可预测ICB治疗的临床获益
研究团队进一步研究了共同突变状态与ICB临床结果之间的关系。
- Rizvi队列中包括34例接受pembrolizumab治疗的NSCLC患者，其中11例患者被分类为co-mut ，co-mut 患者的PFS优于co-mut-的患者。co-mut 患者和co-mut-患者的ORR分别为63.6％和21.7％。
- 用CTLA-4抗体治疗的两个转移性黑色素瘤队列（n = 174）中共有50名患者被分类为co-mut ，该组患者的OS显著更长。
- 38名接受抗PD-1治疗的晚期黑色素瘤患者中， 与co-mut-患者相比，co-mut 患者表现出更长的OS和更高的ORR（73.3％ VS. 43.4％，P = 0.10）。
- 这4个研究列队表明co-mut 是ICB临床获益的预测因子，而不是预后标志物。
（4）在PD-L1表达<50% 或TMB-L患者中，DDR co-mut 患者仍能从抗PD-1的治疗中获益
- 在TMB-L的NSCLC患者中，co-mut 患者的mPFS和ORR均显著高于co-mut-患者。 在TMB-H的NSCLC患者中，co-mut 和co-mut-患者在mPFS或ORR方面没有差异。
- 在PD-L1表达<50％的NSCLC患者中，与co-mut-患者相比，co-mut 患者具有显著的PFS延长和更高的ORR。
- 研究提示在PD-L1表达<50%或TMB-L患者中，co-mut 患者仍能从抗PD-1的治疗中获益。
该回顾性研究证明了DDR系统中HRR-MMR和HRR-BER通路中共突变的存在与更高的TMB、NAL和免疫调节相关基因的表达相关，并且是ICB治疗的潜在预测生物标志物。DDR系统中共同突变状态可能能够识别从ICB治疗中获益的患者群体，而不管PD-L1表达和TMB状态如何。
目前研究者能够明确DDR系统中的基因功能性突变降低了基因组的稳定性，但还尚不清楚DDR通路对基因组稳定性的贡献权重以及通路之间的相互作用如何影响临床研究结果，更多的前瞻性临床研究有待进一步的开展。
注：以上内容根据笔者自己的理解进行整理，若有疏漏异议，欢迎大家留言指正。
参考文献：
(1) Wang Z, Zhao J, Wang G, et al. Comutations in DNA Damage Response Pathways Serve as Potential Biomarkers for Immune Checkpoint Blockade[J]. Cancer Res. 2018 Nov 15;78(22):6486-6496.
(2) Teo MY, Seier K, Ostrovnaya I, et al. Alterations in DNA damage response and repair genes as potential marker of clinical benefit from PD-1/PD-L1 blockade in advanced urothelial cancers[J]. Clin Oncol 2018;36:1685-94.
(3) Dongfeng Tan, Henry T. Lynch. Principles of Molecular Diagnostics and Personalized Cancer Medicine [M] .1st EdItIon.2013.
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讨论：在DDR系统中，HRR通路是经常被提到的通路，其中PARP抑制剂已被广泛用于治疗家族性乳腺癌和其他有BRCA样特征的癌种，那么其抑制的蛋白PARP1具有什么功能呢？
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文案 | 佳佳
编辑 | Z
责编 | Echo
荣誉资质：国家高新技术企业、广东省肿瘤液体活检工程技术中心、深圳市博士后创新实践基地、中国肺癌防治联盟深圳肺癌防治分中心、CSCO团体会员、NVIDIA Inception Program项目成员、先后92次通过卫生部临检中心、欧洲分子遗传实验质控网EMQN及美国CAP认证等国内外室间质评项目