不同酸化剂对常见致病菌的体外抑菌效果研究
酸化剂作为一种无残留、无抗药性、无毒害作用的环保型添加剂，不仅具有抑菌作用，而且还能有效降低饲料在消化肠道内的 pH，提高营养物质的消化利用率，增强机体生物免疫力，缓解应激反应，同时具有改善动物饲料的适口性，增加畜禽的采食量，促进机体生长等功能［1－6］。笔者采用琼脂平板打孔法和二倍稀释法，研究 8 种酸化剂对 3 种标准菌株( 大肠杆菌、金色葡萄球菌和沙门氏菌) 和 1 株临床分离菌( 大肠杆菌) 的抑菌效果，旨在了解不同单一酸化剂对致病细菌的抑菌效果，将酸化剂作为抗生素替代品应用于饲料添加剂生产提供一定的理论依据。
1 材料与方法1．1 材料 甲酸、二甲酸钾、乳酸、苹果酸、酒石酸、富马酸、柠檬酸和磷酸。
1．2 试验菌种 大肠杆菌 ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、肠沙门氏菌 ATCC9120，购于广东环凯微生物科技有限公司。猪大肠杆菌临床株来自佛山科学技术学院动物科学实验室。
1．3 主要仪器和试剂 主要仪器有立式灭菌锅( YXQ－LS－50SⅡ) 、超净工作台( SW－CJ－2D) 、恒温振荡器( MX－F) 、恒温鼓风干燥箱、恒温培养箱等; 主要试剂有 LB 营养肉汤培养基、MH 营养固体琼脂、无菌生理盐水。
1．4 菌悬液的制备 取活化好的菌株，挑取单菌落接种到3 mL的无菌生理盐水中，制备菌体悬浮液，使悬浮液中细菌数为 1×107 CFU/mL。
1．5 抑菌圈直径的测定 在无菌条件下取 200 μL 菌悬液涂布均匀在培养基平板上，用无菌的打孔器在每个平板上均匀打 4 个孔，用移液器将 100 μL 酸化剂液注入孔内。然后，将平板置于 37 ℃恒温培养箱中培养 24 h，培养好后取出并测定其抑菌圈直径。
1．6 最小抑菌浓度(MIC)的测定 用灭菌的营养肉汤培养基将 8 种酸化剂按倍比浓度稀释配制成终浓度为 16．000、8．000、4．000、2．000、1．000、0．500、0．250 和 0．125 g /L 的溶液，并分装到各试管中，每个试管2．7 mL。然后将 300 μL 菌液加入不同浓度的试管中，每个样品做 3 个重复，同时每个梯度组设不含酸化剂只含等量菌液的阳性对照管 1 支以及不含酸化剂也不含菌液的阴性对照管 1 支，置于 37 ℃ 恒温振荡培养箱中培养 16～18 h。肉眼观察证实无菌生长试管中的最低酸化剂浓度即为最小抑菌浓度。使用紫外分光光度仪，以空白组作为校准参照，在580～ 600 nm 波长处检测 4 种菌在不同浓度梯度酸化剂中的生长情况，没有细菌生长的最低稀释浓度即为最小抑菌浓度( MIC) 。
1．7 最小杀菌浓度(MBC)的测定 从各种酸化剂的 MIC和高于 MIC 浓度的各试管中，分别吸取 75 μL 培养物，接种于琼脂培养基，37 ℃恒温培养箱中培养 48 h，肉眼观察无菌落生长的最低酸化剂浓度即为最小杀菌浓度。
2 结果与分析2．1 8 种酸化剂对致病菌的抑菌作用 由表 1 可知，在 8 种酸化剂浓度均为 10 mg /mL 时，对标准大肠杆菌和临床分离大肠杆菌的抑菌效果最强的是甲酸，其次是二甲酸钾，最弱的是磷酸。对标准金色葡萄球菌的抑菌效果最强的是二甲酸钾，其次是酒石酸，最弱的是乳酸。对标准沙门氏菌的抑菌作用最强的是甲酸，其次是酒石酸，最弱的是磷酸。
2．2 8 种酸化剂对致病菌的最小抑菌浓度 由表 2 可知，甲酸对大肠杆菌、临床分离大肠杆菌、金色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌作用明显，在 0．31 mg /mL 浓度以下即可起到抑菌效果。乳酸、富马酸和酒石酸对大肠杆菌、金色葡萄球菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度为 1．25 mg /mL，同时富马酸对分离大肠杆菌的抑菌浓度也是 1．25 mg /mL。柠檬酸、苹果酸、磷酸和二甲酸钾对 4 种菌的最低抑菌浓度为 2．50 mg /mL。另外，6 种酸化剂对临床分离大肠杆菌的最低抑菌浓度也是2．50 mg /mL。这说明甲酸的抑菌浓度最低，其次为富马酸，再次为酒石酸和乳酸，其他酸化剂的抑菌浓度较高。
2．3 8 种酸化剂对致病菌的最小杀菌浓度 由表 3 可知，甲酸对大肠杆菌的最小杀菌浓度最低，为 1．25 mg /mL; 其次是富马酸和酒石酸，最小杀菌浓度为 2．50 mg /mL; 其余 5 种酸化剂的最小杀菌浓度均为 5．00 mg /mL。甲酸和富马酸对临床分离大肠杆菌的最小杀菌浓度最低，为 1．25 mg /mL; 其次是酒石酸，为 2．50 mg /mL; 最弱的是乳酸，最小杀菌浓度为10．00 mg /mL。甲酸对金色葡萄球菌的最小杀菌浓度最低，为 1．25 mg /mL，其次是富马酸和酒石酸，最弱的是乳酸、柠檬酸和苹果酸。甲酸对沙门氏菌的最小杀菌浓度最低，为1．25 mg /mL; 其次是乳酸、富马酸和酒石酸，最弱的是乳酸和柠檬酸浓度是 10．00 mg /mL。这说明在所有单一酸化剂中甲酸的杀菌浓度最低，其次为富马酸和酒石酸，其他酸化剂的杀菌浓度均较高。
3 讨论大肠杆菌、金色葡萄球菌和沙门氏菌是引起畜禽的疾病，在生产中流行范围广、发病率和死亡率高，给畜禽的养殖业造成巨大的经济损失。无机酸化剂在体内可完全解离酸根离子和氢离子，而氢离子通过降低病原菌细胞的渗透压体系，抑制病原菌的生长。
该研究结果表明，8 种单一酸化剂对标准大肠杆菌、金色葡萄球菌、沙门氏菌及临床分离大肠杆菌株具有不同程度的抑菌作用，其中甲酸、富马酸和酒石酸抑菌活性最强，乳酸、苹果酸和柠檬酸则相对最弱。马鑫等［7］研究表明，蛋氨酸羟基类似物和乳酸、甲酸、二甲酸钾对鼠伤寒沙门氏菌、产气荚膜梭菌和空肠弯曲菌都有抑菌作用，与该试验结果相一致。张严等［8］研究表明苯甲酸、山梨酸、柠檬酸、苹果酸和富马酸等对大肠杆菌和金色葡萄球菌均有抑制效果。Cornow�icz［9］在饲料中添加乳酸、丙酸、苹果酸饲喂肉鸡，发现不同酸化剂均可以降低粪便中嗜温细菌和真菌的数目，显著降低了垫草中大肠杆菌、产气荚膜梭菌的数量。Brahma［10］研究表明在饲料中添加乳酸、苹果酸、丙酸可以提高奶牛对疾病的抗耐受能力。
有机酸的抑菌机制可能是一方面解离出氢离子，产生氢离子效应; 另一方面，小分子有机酸可透过细胞壁进入病原菌细胞内，抑制 DNA 和 ＲNA 的合成，进而起到抑菌和杀菌作用。但有关这方面的研究较少，尚需进一步研究。