科研| SCI TOTAL ENVIRON：代谢组学揭示BPA通过激活雄性小鼠肝脏中的LXR来影响脂肪酸和葡萄糖代谢（国人佳作）
编译：荔枝，编辑：谢衣、江舜尧。
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双酚A (BPA)是一种烷基酚类环境雌激素，被广泛用于聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜等重要原料的合成。还可作为生产聚氯乙烯热稳定剂、阻燃剂、橡胶抗氧化剂、农药、增塑剂、紫外线吸收剂等化工产品的原料。BPA也是一种杀菌剂，被广泛的用于生产食品包装材料，牙科填料，婴儿奶瓶等多个方面。此外，BPA的新用途也在不断发展中。人类通过消化系统和皮肤接触含有BPA的食物或包装来吸收BPA，在人血、母乳和羊水中也能检测到不同浓度的BPA。同时BPA使用过程中也会污染大气和水体。肝脏是人体最大、代谢最复杂的器官。它具有许多重要的生理功能，如化合物代谢、蛋白质合成、解毒和内分泌功能等。外源性化学物质可通过血液循环到达肝脏，对肝脏进行攻击，致使肝脏损伤。Liver X receptor （LXR）是核受体超家族成员，在炎症和胆固醇、葡萄糖和脂质等物质的代谢过程中起重要作用。大量研究证实，低剂量的BPA能够通过内分泌信号通路影响生殖、大脑、代谢等功能。目前许多研究已经证实BPA与代谢疾病，生殖系统疾病和性激素依赖性癌症密切相关。而且，BPA对人体的影响是低剂量和长期的，所以低剂量BPA的影响也不容忽视的。文章中用BPA (1，10，50，250 μg/kg)分别灌胃C57BL/6小鼠35 天，然后分析肝脏的代谢组学、组织病理学、分子对接、mRNA表达水平和酶活性；系统地阐明BPA对肝脏脂肪酸和葡萄糖代谢的分子作用，以及BPA诱发低血糖的原因。文章结果显示BPA会影响脂肪酸和葡萄糖代谢，阻断TCA循环，BPA还调节核受体LXR，导致低血糖, 从而影响肝脏的正常代谢功能。
论文ID
原名：Metabonomics reveals bisphenol A affects fatty acid and glucose metabolism through activation of LXR in the liver of male mice
译名：代谢组学揭示BPA通过激活雄性小鼠肝脏中的LXR来影响脂肪酸和葡萄糖代谢
期刊：Science of the Total Environment
IF：5.589
发表时间：2020.2
通讯作者：沈国林
通讯作者单位：中国检验检疫科学研究院，化学品安全研究所
实验设计
把六周龄的雄性小鼠C57BL/6放在湿度约为50±10%，温度为23±2℃，12h的光照和黑暗循环的环境中培养，并提供足够的食物和水。随机选取60只老鼠分为5组，每组12只，其中一组为对照组，另外四组分别灌胃1.0 μg/kg，10.0 μg/kg，50.0 μg/kg和250.0 μg/kg的BPA。每天一次，连续35天。灌胃35天后，用乙醚麻醉，取血。采用全自动生化分析仪检测生化指标。之后用二氧化碳吸入法处死小鼠，称取肝脏重量。将各组中两只小鼠肝脏浸泡于10%福尔马林溶液中进行组织制备，其余10只小鼠进行代谢组学和RT-PCR分析。
将肝脏组织进行均质处理，然后使用QE-Orbitrap进行高分辨率质谱分析。使用MetaboAnalyst 4.0 对对照组和服用不同剂量BPA的实验组小鼠的内源性肝脏代谢物的差异性进行分析，以变量重要性指标（variable importance in projection VIP）大于1确定内源性代谢物，绘制主成分分析图（PCA）、偏最小二乘法判别式（PLS-DA）和拓扑分析图。然后在MetaboAnalyst 4.0中通过Pathway Analysis分析BPA影响肝脏功能的代谢通路，选取影响值大于0.1的代谢通路作为影响肝脏代谢功能的主要代谢通路。使用RT-PCR技术对肝脏内多种酶的编码基因进行检测。为了研究BPA和人体以及小鼠的LXR的相互作用关系，作者使用Autodock-Tools 1.5.6将LXR和BPA转换成PDBQT形式的文件，然后使用Autodock vina 1.1.2进行分子对接研究。用ELISA试剂盒测定酶活，BCA蛋白定量法测定肝匀浆中的蛋白浓度，每个样本三个平行。将肝脏置于福尔马林中进行固定和石蜡包埋，制备肝脏超薄切片，HE染色，最后用中性树脂密封，使用Proscanner APro 5对肝组织进行显微拍摄。试验中相关数据采用SPSS16.0进行分析。
实验结果
1、不同BPA剂量对小鼠肝脏器官系数及生化指标的影响
对小鼠灌胃不同剂量的BPA，每天一次，连续35天。当BPA剂量为250μg/kg时，与对照组相比，实验组体重和肝脏器官系数呈显著下降趋势，如表1.所示；
表1. 不同剂量BPA对小鼠体重及肝脏脏器系数的影响。
表2. BPA对小鼠生化指标的影响。
与生化测试结果一致。肝脏组织学显示，中毒性剂量组肝脏出现轻微水肿，但未见其他明显的病理改变。这些结果表明，在BPA下暴露35天可以影响肝脏和整个动物的正常生理和代谢状态。
2、 BPA对小鼠肝脏内源性代谢物的影响
用MetaboAnalyst 4.0.进行PCA（图. 1 i）和PLS-DA（图. 1 ii）分析，结果显示，对照组和不同剂量的BPA处理组的肝脏完全分离。模型的质量参数为：准确度= 0.8125，R2 = 0.9781,，Q2 = 0.9125。选取VIP > 1的内源性物质，进一步分析BPA对代谢途径的影响。肝脏中含有34种VIP > 1的内源性代谢物，其中19个呈现上升趋势，15个呈现下降趋势（表4.）。这说明BPA影响肝脏的代谢和内源性物质的分泌，导致肝脏成分含量变化明显，主要变化发生在脂肪酸之间。
图1. 肝脏样本的代谢情况。（i）肝样本综合代谢组学数据PCA评分图。模型包括对照组(A)和BPA处理的小鼠（1 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg and 250 μg/kg）。（ii）对照组(A)和BPA处理组的Q-Exactive Orbitrap-MS代谢组数据的PLS-DA模型：1 μg/kg (B)，10 μg/kg (C)，50 μg/kg (D)和250 μg/kg (E)。
表4. 在PLS-DA模型中对照组和BPA处理组的肝脏主要代谢物的平均变化率 (VIP值> 1)
3、 BPA对小鼠肝脏内源性物质代谢途径的影响
如图2所示，MetaboAnalyst 4.0显示了10个受BPA影响且影响值大于0.1内源性物质相关代谢通路。主要影响途径为亚油酸代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成和花生四烯酸代谢。这些结果表明，BPA影响肝脏内脂肪酸和氨基酸的代谢和合成，导致肝脏内源性物质含量发生变化。
图2. 不同BPA剂量组对小鼠肝脏代谢相关代谢途径的影响。(a)亚油酸代谢，(b)牛磺酸和次牛磺酸代谢，(c)缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，(d)花生四烯酸代谢，(e)组氨酸代谢，(f)烟酸和烟酰胺代谢，(g)甘油磷脂代谢，(h)丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢,(i)鞘脂类代谢。
4、 差异表达内源物质的相关分析和层次聚类分析
肝脏内源物质差异表达相关分析结果如图3A所示，水平轴和垂直轴都表示变量信息，颜色越深，相关性越强。红色表示正相关，绿色表示负相关。图3A为差异表达的内源性物质之间的相关性分析。从横轴上看，同一枝下的物质正相关最强，即当一种物质的含量增加或减少时，强相关的物质会增加或减少。通过层次聚类分析得到的热图，如图3B所示，横轴和纵轴分别表示样本和变量信息，颜色的深浅反映了变量的大小；红色表示含量增加，绿色表示含量减少，颜色越深，变化越大。从图3B可以直观地看出34个差异表达的内源物质在不同组间的变化趋势。以上结果进一步说明BPA影响肝脏内源性物质的水平。
图3. 数据的应用相关性分析和层次聚类分析。(A)对照组和不同BPA剂量组小鼠肝脏内差异内源性物质相关性的层次聚类分析，(B)对照组和不同BPA剂量组小鼠肝脏内差异内源性物质相关性的热成像分析。
5、 BPA对小鼠肝脏脂肪酸代谢的影响
脂肪酸代谢在肝脏中最为普遍。血液中的脂类浓度与肝脏的脂肪酸代谢有很强的正相关关系，而且内源性脂肪主要来源于肝脏。脂肪酸代谢包括脂肪酸的分解和合成，其代谢与肝脏中脂肪酸代谢酶的活性有关。我们发现与对照组相比实验组小鼠肝脏中长链脂肪酸的比例呈上升趋势（表4.）。与对照组相比，实验组小鼠中与肝脏脂肪酸合成相关的acc的mRNA水平随着BPA量的增加呈升高趋势，而控制脂质合成的lxr的表达也升高（图4A.）。当BPA剂量到50 μg/kg时，花生四烯酸、亚油酸、棕榈酸等长链脂肪酸的比例则有所下降。根据图4和表3得知，与对照组相比，acs的mRNA水平和酶活性增加与BPA增加剂量呈正相关；acs的主要功能是激活长链脂肪酸转化为长链乙酰辅酶A；这表明长链脂肪酸的比例的下降与acs的活性增加有关。与此同时，与对照组相比，cd36的mRNA水平随着BPA剂量的增加而降低。cd36在脂肪酸发生强氧化代谢的组织（如肝脏）中高度表达，并且在长链脂肪酸进入细胞的转运过程中发挥重要作用。如表5所示，血浆中长链脂肪酸比例降低，说明肝脏中长链脂肪酸的增加是脂肪酸合成的结果。当BPA剂量达到250 lg/kg时，所有长链脂肪酸均呈上升趋势（表4），说明该剂量下脂肪酸的合成强于脂肪酸的分解。与对照组相比，cpt1的mRNA水平呈下降趋势（图4A.）这说明BPA通过抑制cpt1的酶活性，降低了长链酰基辅酶A的氧化分解速率，从而减弱脂肪酸的β氧化，这也是脂肪酸在肝脏内积累的原因之一，与肝脏代谢途径分析的结果一致。以上结果表明，随着BPA剂量的增加，越来越多的长链脂肪酸被转化形成酰基辅酶A，而BPA抑制了线粒体中酰基辅酶A的正常运输和β氧化，阻碍了正常的线粒体供应，影响肝脏的生理和代谢功能。此外，脂肪酸代谢途径受到影响，导致其在肝脏中积累。高浓度的脂肪酰基物质会对细胞造成直接损害。IL-1b，是引发肝损伤的细胞因子；和对照组相比，BPA处理组中IL-1b的水平有所增加（表3.），这可能与脂肪酰基物的高浓度积累有关。BPA处理组中溶血磷脂的比例高于对照组（表4.）。肝脏中pla2的酶活性随着BPA剂量的增加而增加（表3.）。溶血磷脂是一类表面活性很强的物质，它能破坏红细胞等细胞膜，引起溶血或细胞坏死。这进一步解释了肝脏中细胞因子IL-1b含量的增加。我们的研究进一步证实了BPA可以促进肝脏脂肪酸合成酶基因表达，引起肝脏脂肪酸积累；但是没有明显的脂质沉积，可能与所研究的小鼠品系有关。
表5. 血浆长链脂肪酸和肝脏TCA循环代谢物的平均变化
6、 BPA对小鼠肝脏葡萄糖代谢的影响
肝脏是碳水化合物代谢最重要的器官，大部分参与碳水化合物代谢的酶都存在肝脏中。当血糖波动时，肝脏主要通过调节葡萄糖的输出和利用来维持其水平。与对照组相比，随着BPA剂量的增加，血糖浓度下降（表2.）。如表4所示，肝脏中的葡萄糖呈现下降趋势，说明BPA能抑制肝脏中葡萄糖的产生。与对照组相比，BPA处理组的己糖激酶2（hk2）、甘油醛-3-磷酸脱氢（gapdh）和烯醇化酶的mRNA浓度有所增加（图4B.）。BPA处理组的葡萄糖六磷酸水平相比对照组有所增加，说明BPA促进了肝脏中的糖酵解。但是，随着BPA处理量的增加，肝脏中丙酮酸的水平呈下降趋势，丙酮酸激酶的mRNA水平也呈下降趋势，催化生成的丙酮酸也少了（表5.）。这表明BPA抑制糖酵解途的最后一步，但肝细胞仍然产生足够的ATP。与对照组相比，乳酸脱氢酶活性随BPA剂量的增加而降低（表3.）。BPA处理组肝脏中乳酸含量下降，表明BPA抑制肝脏的厌氧糖酵解（表4）。参与糖异生作用的pck1和g6pc基因的mRNA水平随着BPA剂量的增加呈下降趋势（图4B.）。此外，与对照组比较，乳酸脱氢酶（表3）和乳酸（表4）含量在BPA处理组肝脏中下降，说明BPA阻碍了肝脏糖异生。因此，肝细胞内糖异生反应在调节血糖浓度中起重要作用。上述结果表明，血糖浓度的降低与糖异生作用的抑制有关。G6Pase的抑制也会影响肝糖原的分解，这进一步解释了肝脏和血浆中葡萄糖浓度的下降。尽管肝细胞内葡萄糖转运蛋白glut2的mRNA水平呈上升趋势（图4B.），由于肝内糖异生和糖原分解受到抑制，肝脏中葡萄糖的比例仍在下降。综上所述，BPA处理35天后，可以促进肝脏正常糖酵解，抑制厌氧糖酵解和糖异生，导致低血糖；此外，BPA促进肝脏糖酵解，补充抑制脂肪酸β氧化所需的ATP，维持肝脏的正常生理功能。
代谢核受体参与糖脂和能量代谢。LXRs是核受体超家族的成员。LXR是葡萄糖代谢的重要调节因子。LXR的激活可明显抑制PCK、G-6-Pase等肝脏糖异生酶的表达。与对照组相比，BPA增强了肝脏中lxr的mRNA水平（图4A），而糖异生相关基因pck1和g6pc的mRNA水平随着BPA剂量的增加呈下降趋势（图4B.）,说明BPA通过调节LXR影响肝脏脂肪酸合成和葡萄糖代谢。为了说明BPA和lxr之间的相关性，我们进行了分子对接分析，这表明BPA在小鼠和人类LXR的活动中紧密结合（图5A和B）BPA的另一个4-羟基位于一个疏水囊中，在小鼠体内，它由氨基酸残基phe255、Leu-329和phe333组成，而在人体内，它由氨基酸残基Leu-274、Ala-275组成，Met-312和phe329有稳定的疏水相互作用。图5C和D所示的BPA的4-羟基与小鼠氨基酸残基phe255和phe333的侧链分别形成CH-p相互作用。以上结果表明，处理35d后，BPA通过诱导LXR表达，调控肝脏脂肪酸和葡萄糖代谢相关基因，影响肝脏正常的生理和代谢功能。、
图5. 将BPA与小鼠和人LXR对接。(A) BPA与小鼠LXR的活性对接（总体看），(B) BPA与人类LXR的活性对接（总体看），(C) BPA与小鼠LXR的活性对接（详细图），(D) BPA与人类LXR的活性对接（详细图） 。
8、 BPA对肝线粒体能量代谢的影响
肝脏是环境中毒的重要器官，也是外源性物质代谢的重要器官。许多重要的代谢过程，如糖异生、尿素合成、解毒和蛋白质合成都在肝脏中进行。肝脏能量下降肯定会影响上述代谢活动；因此，维持肝脏的能量水平是至关重要的。线粒体是真核生物能量代谢的重要枢纽。线粒体通过TCA循环和电子传递链产生能量。它是氧化磷酸化和产生ATP的主要细胞位置，是对各种损伤最敏感的细胞器之一。上述结果表明，BPA促进糖酵解，抑制厌氧糖酵解和糖质新生，但在糖酵解过程的最后一步，抑制作用是BPA剂量依赖性的，导致进入三羧酸循环的丙酮酸减少。此外，BPA还能抑制肝细胞液中脂肪酸的转运，从而影响线粒体中乙酰COA的β氧化。与对照组相比，BPA处理组肝脏中AMP的比例呈上升趋势，AMP是由ATP和ADP释放能量形成的。AMP可与磷酸基团结合形成二磷酸腺苷（ADP）和三磷酸腺苷（ATP）。其在处理组中的比例增加，说明肝脏需要分解ATP来获得足够的能量，并且合成ATP的效率下降。以上结果表明，BPA可抑制小鼠肝细胞线粒体的TCA循环，因此，不能从ATP中为肝脏的正常生理和代谢功能提供足够的能量。试验进一步指出了通过促进糖酵解来提供ATP的必要性。由于处理剂量和时间的限制，肝细胞仅有轻度水肿，未见其他明显的病理变化，其对肝脏病理变化的影响仍在研究中。
讨论
许多研究已经证实BPA与代谢疾病，生殖系统疾病和性激素依赖性癌症密切相关。本研究通过代谢组学的方法系统地阐明BPA对肝脏脂肪酸和葡萄糖代谢的分子作用，以及BPA诱发低血糖的原因。
作者利用高分辨率质谱代谢组学结合生物信息学分析技术，阐明了双酚a影响肝脏代谢功能的机制。首先，通过代谢组学方法检测到与肝脏代谢功能相关的内源性物质受到BPA不同程度的影响；其次，利用分子生物学等技术，发现BPA通过抑制脂肪酸的摄取和氧化分解，促进脂肪酸的合成和好氧糖酵解，阻碍厌氧糖酵解、糖异生和TCA循环来影响肝脏代谢功能（图 6.）。总而言之，这些影响扰乱了肝脏的正常代谢功能。此外，BPA可以上调小鼠的LXR，而低血糖是由LXR对肝脏糖异生作用的调节抑制引起的，这种抑制作用降低了葡萄糖的产生和糖原的分解。
图6. BPA对小鼠肝脏相关代谢途径的影响。
原文网址：https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.134681