科研 | 北京协和医院：新冠肺炎相关性肺损伤的分子病理特征：基于临床标本的蛋白质组学初步报告
编译：周仙杰，编辑：Emma、江舜尧。
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新冠肺炎（COVID-19）患者部分为重症肺炎并具有较高的死亡率，COVID-19的大流行，使其已成为全球突发公共卫生事件。目前COVID-19的分子和病理特征尚不清楚，本研究使用刚死亡的COVID-19患者的新鲜肺组织，通过蛋白质组学方法研究COVID-19发病机理的分子机制。病毒灭活后，利用定量蛋白质组学方法检测SARS-CoV-2感染的肺组织中蛋白质组的变化，并使用生物信息学进行分析。本研究鉴定出的差异表达蛋白，涉及多种基本生物学过程，包括细胞代谢、凝血、免疫反应、血管生成和细胞微环境调节。SARS-CoV-2感染的肺组织中蛋白质组广泛失调，并且部分炎性因子上调，其可能原因是NF-κB信号传导被激活。本文系统地概述了SARS-CoV-2感染后肺的分子病理学特征，并为控制COVID-19大流行急需的治疗靶点提供了科学依据。
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实验设计
实验结果
1. COVID-19肺组织的蛋白质组学特征
两名确诊为COVID-19的患者，胸部CT显示双侧肺部有毛玻璃样混浊，从这两名患者身上共取了3个肺组织样本。组织学检查发现肺泡壁水肿、肺泡壁血管舒张、充血、透明膜形成、多核巨细胞、肺泡细胞核增大以及病毒包涵体（图1a）。此外，本文对SARS-CoV-2的结构蛋白进行了染色（标记），并在COVID-19患者肺组织中检测到了该蛋白（图1a）。
病毒灭活后，采用定量蛋白质组学方法结合生物信息学分析SARS-CoV-2感染的人肺组织中的蛋白质组学变化（图1b）。本研究共鉴定出4128种蛋白质，其中在COVID-19肺组织中鉴定出3321种蛋白质，对照样本中鉴定出3652种蛋白质，COVID-19样本和对照样本共有的蛋白质有2745种（占66.5％）。
主成分分析表明，COVID-19和对照组中的蛋白质具有差异，两组间差异表达蛋白有641种（BH校正P <0.05，log2 COVID-19/Control>1或<-1），SARS-CoV-2感染样本中，上调蛋白质有222种（> 2倍），下调蛋白质有419种（<1/2倍）（图1c）。
GO功能注释分析显示，与9种不同细胞器/结构相关的蛋白质显著性改变（图1d），大多数差异表达蛋白位于细胞核中（42.7％的上调蛋白和43.2％的下调蛋白），这提示差异表达蛋白可能与病毒感染诱导的基因转录有关。本研究检测了病毒感染相关RIG-I样受体信号通路的RIG-I、IPS-I和TNF受体相关因子（TRAFs），发现RIG-I通路被激活（图2）。SARS-CoV-2感染下调的蛋白与内质网（18.6％）、溶酶体（9.0％）、核糖体（5.3％）、细胞骨架（23.4％）和细胞膜（19.1％）相关。
KEGG差异蛋白通路富集分析表明，COVID-19介导的通路富集与细胞代谢和凝血级联有关，这可能是由于病毒感染引起缺氧所致。值得注意的是，在COVID-19组织中，与病灶粘附和ECM受体相互作用相关的蛋白质均降低了，这表明SARS-CoV-2感染可能导致肺细胞外微环境失调，揭示了SARS-CoV-2相关肺损伤的可能机制。综上所述，SARS-CoV-2感染，导致多种细胞成分和信号转导途径发生改变。
红细胞运输氧气和去除周围组织代谢产生的二氧化碳，依赖于肺泡I型细胞（ATI）进行气体交换。铁氧化酶血浆铜蓝蛋白（CP）参与Fe(II)转铁蛋白到Fe(III)转铁蛋白的过氧化反应，COVID-19肺组织中CP显著上调（图1c），CP持续性过表达可能导致过量耗氧而影响正常呼吸。SLC4A1是红细胞膜上的主要整合糖蛋白，参与肺中二氧化碳运输和肾脏中氯化物-碳酸氢盐交换，COVID-19肺组织中SLC4A1显著上调（图1c），SLC4A1的异常表达可能导致肺部气体交换功能障碍和尿液的酸化。SLC2A1是溶质载体家族另一成员，也是主要的葡萄糖转运蛋白，SARS-CoV-2感染肺组织中SLC2A1上调（图1c），这可能导致氧化还原反应的异常。此外，COVID-19患者肺组织中参与氧化还原反应的多种蛋白质均过表达，包括谷氨酸-半胱氨酸连接酶、谷胱甘肽过氧化物酶1、精氨酸酶(ARG)、亚甲基四氢叶酸脱氢酶1、鸟苷单磷酸还原酶2、硫氧还蛋白、CP、过氧化物还原酶1和酸性磷酸酶1，其中ARG1可以通过降解精氨酸而促进肺的急性2型炎症。
在呼吸诱导的扩张和收缩过程中，肺泡结构的稳定是通过肺表面活性物质的形成和维持来实现的。肺表面活性物质是由肺泡II型细胞(ATII)分泌的一种复杂的脂蛋白，包括SFTPA、SFTPB、SFTPC和SFTPD，这些肺表面活性蛋白是肺泡中层状体形成和表面活性膜生成所必需的，具有降低肺泡表面张力的作用。SFTPA1有助于降低哺乳动物肺泡中气液界面的表面张力，对正常呼吸至关重要，值得注意的是，COVID-19组中SFTPA1显著下调（图1c）。SFTPB缺陷和/或突变会导致婴儿呼吸窘迫综合征，COVID-19患者肺组织中，SFTPB表达水平显著降低（图1c）。此外，膜联蛋白A2（ANXA2）可以调节肺泡II型细胞中含层状体的表面活性物质的分泌，COVID-19患者肺组织中ANXA2显著下调（图1c）。
图1 SARS-CoV-2感染人肺组织的定量蛋白质组学特征
a 苏木精-曙红染色，免疫荧光分析ACE2和刺突蛋白的表达（COVID-19 &Control，比例尺：50μm）。红色和蓝色箭头，分别指向肺细胞的核和病毒包涵体。b COVID-19患者肺组织的蛋白质组学分析示意图。c 蛋白丰度差异火山图。横坐标为COVID-19/ Control的差异倍数（以2为底的对数变换），纵坐标为差异的显著性P-value（以10 为底的对数变换）。差异蛋白显著性阈值线（调整后的p <0.05和COVID-19/Control> 2或<1/2），红色为上调蛋白，蓝色为下调蛋白。d COVID-19患者肺组织中细胞成分变化示意图。红色和蓝色字体，分别表示上调和下调的蛋白（COVID-19 vs Control）。
2. 蛋白质交互网络揭示了COVID-19肺组织生物学进程的失衡
本研究使用蛋白质-蛋白质交互网络概述差异表达蛋白相关的生物学过程，SARS-CoV-2感染肺组织中有大量的与转录相关的蛋白质上调，提示感染激活了转录途径，这与核成分改变的结果一致（图1d）。此外，SARS-CoV-2感染肺组织中，调节蛋白质周转（包括翻译和蛋白水解作用）的蛋白质上调，这可能导致COVID-19肺组织中蛋白的整体差异表达。本文鉴定出COVID-19患者肺组织中氧化还原反应失衡（图1c），大量上调的蛋白质（COVID-19/Control差异倍数> 2.0）与氧的转运、活性氧的反应以及过氧化氢的产生有关，异常的氧化还原反应终将导致代谢紊乱，COVID-19组嘌呤和亚铁血红素的生物合成以及除糖酵解外的所有血红蛋白代谢过程均上调，能量代谢过程严重损耗，这可能是导致患者呼吸衰竭的原因。
COVID-19肺组织中，免疫相关的Fc-ε相关信号（LYN和PI3K）、NIK/NF-κB（ub、CUL1、SKP1、蛋白酶体和NFKB2）以及C型凝集素受体（PTPN11和CARD9）通路被激活（图2）。先前文献已报道了COVID-19患者血液中的炎症因子，并提示患者肺组织中存在细胞因子风暴。本研究检测了NF-κB通路相关分子，在COVID-19患者肺组织中均显示上调，包括上游蛋白TLR4、CD40及BAFF受体和TRAF蛋白家族成员（TRAF2、TRAF3、TRAF6），下游细胞因子（IL-6、IL-8、TNFα、IFNα、ICAM1）及趋化因子CXCL12，SARS-CoV-2感染后激活了经典NF-κB信号（p65）和非经典信号（p52）（图3）。综上所述，这些结果表明蛋白质组生物进程和信号通路的功能紊乱可能在COVID-19的发病机理中起重要作用。
COVID-19肺组织中，下调的蛋白质均集中在细胞内部，并具有促进细胞增殖、表皮发育及血管生成等进程的作用。SARS-CoV-2感染可能严重破坏了维持细胞形态、命运、血管生成和再生能力的蛋白质，尤其是血管生成通路，例如，肝配蛋白受体和血管内皮生长因子受体降低了，血管再生和修复能力的丧失可能导致凝血功能障碍，COVID-19组中凝血蛋白FGs（FGA，FGB和FGG）的表达和凝血级联的激活均升高（图2和图3a）。
图2 筛选COVID-19差异蛋白的细胞通路
蛋白质节点的颜色表示在KEGG信号通路中蛋白表达的差异倍数（以2为底的对数变换；COVID-19 vs Control）。红色和蓝色框，分别表示蛋白质丰度的增加和降低（COVID-19vs Control）。
图3 COVID-19肺组织的信号通路失衡
免疫组化分析a TLR4、CD40、BAFF和IL-6；c IL-8、TNFα、IFNα和CXCL12（COVID-19 vs Control，比例尺：50μm）。b 免疫荧光分析，TRAF2、TRAF3、TRAF6、P52Ser和ICAM1蛋白表达（COVID-19 vs Control，比例尺：50μm）。
3. 细胞外基质的改变损害了COVID-19肺组织的结构和功能
本研究发现，与微环境相互作用的蛋白质下调了，包括细胞间粘附，细胞间基质粘附和ECM重塑相关的蛋白。同时，本研究还发现，与ECM相关通路有关的蛋白质表达减少（图2），这可能会大大降低肌动蛋白的聚合反应（图2）。据报道，发育器官形成、体内稳态和损伤修复期间，ECM的变化可改变肺部结构，并且参与支气管肺发育不良、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和特发性肺纤维化。COVID-19肺中，ECM相关蛋白，上调的有71种（COVID-19/Control> 2）和下调的有141种（COVID-19/Control <1/2;图4a，b）。值得注意的是，71种上调蛋白中有73.2％是可溶性调节因子，包括27种ECM调节因子、11种ECM关联蛋白和14种分泌因子。在分泌因子中，又包含可以激活先天免疫的钙结合蛋白S100A1、S100A3、S100A6、S100A8、S100A14和S100P（图4c）。此外，非典型NF-κB2/NFKB2通路的激活剂ZFP91上调（log2COVID-19/Control=1.70），这与非典型NF-κB2/NFKB2通路激活的结果一致（图2）。粘蛋白（MUC5B）是由粘液分泌的高度糖基化大分子物质，是一种ECM关联蛋白，且与COPD相关，MUC5B在COVID-19患者肺组织中上调。与之相反，ECM相关蛋白中抗凝蛋白显著降低，例如Annexin家族成员ANXA3、ANXA4、ANXA5和ANXA8L1（图4d），这与COVID-19患者凝血功能障碍的结果一致（图2和图4a）。在COVID-19肺组织中，表面活性蛋白SFTPC和SFTPD表达水平非常低，这表明SARS-CoV-2感染肺组织中所有四种表面活性蛋白的表达均降低。
SARS-CoV-2感染的样本中大量核心ECM蛋白表达下调（COVID-19/Control<1/2），包括16种胶原蛋白、12种蛋白聚糖和56种糖蛋白。ECM蛋白，例如蛋白聚糖、纤维胶原蛋白、糖蛋白以及弹性蛋白的蛋白质降解或修饰可能产生新抗原，绑定并激活肺中的免疫细胞，从而导致肺气肿。SARS-CoV-2感染后，26种活性蛋白酶和38种蛋白酶抑制蛋白显著改变，包括ECM调节因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员、组织蛋白酶和基质金属蛋白酶（MMPs）（图4e）。值得注意的是，SARS-CoV-2感染，弹性蛋白酶（ELANE）升高，但弹性蛋白（ELN）降低（图4e），异常的弹性蛋白纤维（碎片化、集群分布）和弹性蛋白含量的改变，可能会导致肺气肿。COVID-19肺组织中，金属蛋白酶MMP2及MMP8和组织蛋白酶CTSS上调（图4e），这些发现可能对COPD和肺纤维化的研究也具有意义。此外，与血管生成相关的蛋白酶也下调了，包括EGF样蛋白7（EGFL7）、腱蛋白样蛋白1（CHRDL1）、C型凝集素结构域14A（CLEC14A）、丛状蛋白结构域2（PLXDC2）、MMP9和CTSL，这与COVID-19肺中血管生成受到抑制的结果一致（图2）。这些结果表明，ECM酶系统的功能紊乱与COVID-19发病机制相关。
ECM在上呼吸道提供结构支撑防止气道塌陷，在下呼吸道和脉管系统中可以形成一层专用的基底膜（BM）。本研究表明在COVID-19肺中BM的主要成分均降低了，包括硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（AGRN和HSPG2）、巢蛋白（NID1和NID2）、层粘连蛋白（LAMA3、LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2、LAMB3、LAMC1、LAMC2和LAMC3）、胶原VI（COL6A1、COL6A2、COL6A3、COL6A5和COL6A6）、膜联蛋白A2（ANXA2）和纤连蛋白（FN1）（图4f），肺BM主要成分的降低可能损害支气管壁的弹性、支气管上皮细胞的附着、细胞命运和肺泡及肺液平衡的功能。据报道AnxA2-/-小鼠的肺，可导致支气管上皮细胞畸形、高水平细胞凋亡和细胞消亡，而胶原VI的突变可能引起一系列的肌萎缩症和呼吸衰竭。本研究还发现，与间质和上皮细胞转化相关的ECM下调（图4f），例如钙粘蛋白超家族的经典钙粘蛋白CDH1显著下调（图4g），提示COVID-19患者可能发展为肺纤维化。
图4 COVID-19患者肺中ECM蛋白的基质分析和差异表达
饼形图表示，核心ECM和ECM相关蛋白（ECM调节因子、ECM关联蛋白和分泌因子）的数量和比例。a COVID-19患者肺组织中丰度增加的蛋白，b丰度降低的蛋白。肺组织中鉴定出的c分泌因子类型，d ECM关联蛋白，e ECM调节因子(COVID-19 vs Control)；y轴代表log2 COVID-19/Control的值。f 热图分析，BM、EMT和MET通路中鉴定出的6种ECM类别（基于上述COVID-19/ Control的差异倍数，以2为底的对数变换）。红色和蓝色框，分别表示SARS-CoV-2感染的肺组织中蛋白质丰度的增加和降低。g 免疫荧光分析，肺组织中CDH1表达（COVID-19 vs Control，比例尺：50μm）
讨论
目前，流行病学和病理学研究提供了COVID-19相关肺炎的临床病理学方面的描述性信息，然而分子发病机制尚待阐明。众所周知，肺气体交换取决于肺的结构基础，尤其取决于肺泡中空气和肺泡毛细血管中血液间的连接结构。本研究结果显示，SARS-CoV-2感染的肺组织亚结构发生了3种改变，（i）表面活性蛋白质的改变，表面活性蛋白是已知的肺泡表面活性物质的关键成分，它们通过自身独特的蛋白结构和活性促进肺稳态，本研究发现COVID-19患者肺组织中4种表面活性蛋白显著下调，这可能导致呼吸窘迫。因此，在临床治疗中纠正表面活性物质损失，可能缓解患者的呼吸道症状。（ii）细胞-基质粘附的改变，BM的ECM作为重要的微环境，不仅有助于上皮细胞或内皮细胞粘附到肺组织支架上，而且能维持细胞的极性和功能，本研究结果显示COVID-19患者肺组织中BM上的大部分ECM丢失，这可能导致上皮细胞脱落和功能障碍。（iii）核心ECM的改变，ECM是构成所有多细胞生物支架的数百种蛋白质的复合物，并提供了一种生物活性结构，可通过化学和机械信号从根本上控制细胞的行为，COVID-19肺组织中大部分核心ECM丢失，包括胶原蛋白、ECM糖蛋白和蛋白聚糖，这可能导致COVID-19肺机械性能的根本性损伤。
另一个重要发现是COVID-19肺中的凝血功能异常，高凝状态可导致微血管血栓形成和败血症以及缺氧和血管重塑，从而导致呼吸功能丧失，而败血症又可导致大量炎性细胞因子的产生，转而又激活凝血途径。同时，本研究发现COVID-19患者肺中，许多免疫相关信号通路被激活，包括Fc-ε、NF-κB/NFKB2和C型凝集素受体。值得注意的是，非经典的NF-κB/NFKB2途径被显著激活，可能导致趋化因子和细胞因子的产生，以及淋巴器官发生，这在其他呼吸道病毒，例如流感所致的细胞因子风暴中从未报道过。因此，非经典NF-κB/NFKB2途径是SARS-CoV-2感染独特之处，可能是药物设计的潜在靶标。
综上所述，本研究首次报道了SARS-CoV-2感染临床样本组织中的分子水平特征，COVID-19患者肺组织表现出多分子特征，包括呼气性呼吸困难、凝血功能紊乱、免疫激活和ECM失衡，这从蛋白质层面解释了重症COVID-19病例的主要临床表现。本研究为生理状态下SARS-CoV-2的致病机制提供了系统的科学见解，有助于更好的理解新冠肺炎。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7557250/