科研 | Nature Genetics：高精度渐渗系群体分析揭示番茄果实风味和抗病性的遗传基础
编译：李飞，编辑：Tracy、江舜尧。
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番茄的驯化和育种过程极大地改变了果实成熟及其伴随的无数代谢过程。导致现代番茄品种丧失了一些重要的果实品质，例如抗旱和抗病能力等。在这项研究中，作者构建了精细作图群体，进行转录组、代谢组和抗病能力测量，对番茄果实进行整合QTL分析。所使用的580个渐渗系，在番茄栽培品种M82的背景下，每个品系均携带野生番茄Solanum pennellii的小片段遗传物质，这一群体具有极高的分辨率。作者对整个种群的果实进行多角度的分析，包括不同发育阶段的RNA测序、基于质谱的代谢组学和病原体敏感性测定，由此产生的海量数据资源被用于多层次的QTL分析中，并确定了番茄果实中基因序列变异、基因表达和代谢产物水平的变化以及最终表型变化的因果关系。从庞大的数据信息中，作者集中研究了与食用品质相关的代谢物质和对病原体的抗性两个方面，这两个方面是野生和驯化番茄差异最大的地方。作者鉴定并分析了番茄果实中生物碱α-番茄碱代谢途径的关键酶，这种生物碱赋予番茄果实苦味，妨碍野生番茄被食用，但对于野生番茄抗病能力具有重要影响。此外，作者鉴定并验证了与抗病能力相关的基因。这些结果建立了理解番茄果实成熟过程中新陈代谢和病原体抗性的框架，并提供了对番茄果实关键品质性状的理解。本文研究生成的大量数据为科学界提供了重要的研究资源。
论文ID
实验设计
实验结果
1.对580个渐渗系的果实进行分析，获得多组学数据资源
作者在两个果实发育阶段（破色期，开花后约44 d和红色期，开花后约48 d）对580个自交系的果皮进行分析（图1a）。使用高分辨率质谱法进行两个发育阶段样品的非靶向代谢组检测。使用TRANSeq3'-末端RNA测序（RNA-seq）分析了破色期样品的基因表达。同时，作者用病原体B. cinerea感染整套渐渗系，并对病情程度进行定量，从而对红色成熟期的果实进行病原体敏感性分析。
图1 实验设计和基本思路、原理
a，采样部位和时间点示意图，列举生成和收集的数据集。b，作图群体中S. pennellii基因渗入位置展示图。顶部的条形图，显示了在该处有S.pennellii渗入的番茄渐渗系株系数量。c，本文关键概念的示例图。描绘了六个假象的BIL株系的单个染色体。在这6个株系中，S.pennellii渗入（红色）将染色体分为21个bins。将在该bin范围内具有野生番茄S.pennellii基因的BIL株系，与在该区域具有S. lycopersicum基因型的BILs进行基因表达、代谢组和抗病性比较。d，番茄基因与所有测量变量之间可能关系的示例图。
本研究中使用的所有渐渗系，基因组中的S. pennellii基因渗入情况已使用遗传标记进行了定位。作者使用定位结果将番茄基因组划分为狭窄的基因组区域（称为bin）。每个bin与在基因组该区域含有野生番茄渗入片段的品系关联。作者总共定义了1,296个bin。Bin所关联的品系个数中位数为19个（每个bin关联品系在1个到77个番茄品系之间；图1b）。每个bin的分辨率中位数为9个带注释的基因（µ = 26.1），表达基因的中位数为四个表达基因（µ = 9.9）。
作者使用线性模型，将转录本、代谢物和病原菌敏感性与特定bin的渗入进行统计学关联（图1c），用于推断基因-转录本-代谢物-病原体敏感性的互作通路（图1d）。
2.通过表达QTL（eQTL）分析发现了果实发育过程中的基因调控相互作用
转录组学分析表明，野生番茄的基因渗入与特定基因的表达之间存在显著关联（图2a）。在11,992个基因中，大约有9％（1100个转录本）表现为至少一个重要的eQTL。582个转录本具有显著的顺式eQTL，496个显示至少一个反式eQTL。虽然每个bin中的顺式eQTL数量与给定bin中存在的基因数量成比例。但与给定bin相关的反式eQTL数量却有很大差异，并没有显示出这种关系。每个bin中反式eQTL数量的分布与在随机排列测试中获得的分布相反，突出了大量反式eQTL热点的存在。
图2 野生番茄基因渐渗系eQTL定位
a，每个bin中差异表达基因（仅展示了反式eQTL）数目的分布。阈值为LOD> 5和倍数变化> 2。上调和下调的基因分别显示在上部和下部。正文中提到的已知成熟调节子的基因座均以其基因名称缩写标记。Fujisawa等(2014)染色质免疫沉淀和突变体鉴定出的FUL1（b）和RIN（c）所有靶标基因的基因组定位和eQTLs。
3.S. pennellii基因的渗入导致果实成熟过程相关的基因表达变化
野生番茄基因渗入而上调的转录本参与次级代谢、光合作用、纤维素合成、角质层形成、脂肪酸生物合成、细胞分裂素、油菜素甾体信号传导和生物应激反应。由于基因渗入而被下调的基因与淀粉合成、成熟调节和苯丙烷代谢特别相关。值得注意的是，野生番茄关键果实成熟调节因子（如TAGL1，FUL1和FUL2，ARF2A和ERF1）在基因组位点上的基因渗入，与反式eQTL热点的存在相关。相反，在CNR\RIN\NOR\NR等基因渗入位点，未观察到此类热点，表明仅一部分已知的果实成熟调节因子受到S.pennellii渗入的影响。FUL1和FUL2基因座中的eQTL热点包括这些转录因子的几个靶基因。FUL1的四个靶基因，包括肉桂酸-COA还原酶，羟基肉桂酸转移酶和果胶酸裂解酶同源物，以及FUL1基因本身，被差异表达。这些基因均可能由于FUL1基因座的渗入而被下调。FUL2基因座及其靶基因观察到了相似的模式。尽管RIN渗入并没有导致eQTL热点的发生，但两个RIN下游基因（即ACS4和ER1）已定位到RIN基因座（图2c）。有趣的是，大多数FUL1，FUL2和RIN的重要eQTL的直接靶标并未与FUL1，FUL2和RIN基因座共定位。该结果表明，观察到的大多数eQTL是基因调控网络下游的次级效应。这是由于基因渗入通过基因调控网络传播的基因扰动所致。因此，其中只有一部分反映了调控基因与靶基因之间的直接互动。相关分析进一步支持了野生番茄基因渗入对RIN，FUL1和FUL2基因座的不同影响。这表明，尽管在所有渐渗系中FUL1和FUL2的靶基因的表达始终与其对应的调控基因的表达趋势一致，但RIN的靶基因却不是这样。
4.代谢组学分析确定了果实成熟过程中次级代谢的酶促瓶颈
使用LC-qTOF-MS，对破色期和红色成熟期的果皮组织进行代谢组学分析。分别在破色期和红色期样品中检测到526和1,019个代谢物。在破色期和红色期代谢物中，分别将79和91个代谢物进行注释。在破色期，有229种代谢产物（其中43个注释物质）是显著的代谢QTL（mQTL），而在红色期，有686种代谢产物（有83个有注释）是显著的代谢QTL。和eQTL所观察到的一样，多种代谢产物的mQTL出现在热点中。这些mQTL主要是针对某一发育阶段的，并且代表了化学相关代谢物积累的改变。观察到的mQTL通常与关键调控或酶促基因位点相关。例如，MYB12转录因子基因座位于1号染色体上的类黄酮QTL内。
Bin424中的mQTL是最大的代谢变化热点，包含249种代谢物的差异积累。其中包括至少22种在红色期显著下调的类黄酮物质，而芦丁和4种山柰素则上调。芦丁和山柰素的上调在果实发育的破色期阶段也很明显，表明该基因座在果实发育和成熟过程中持续发挥作用。值得注意的是，CHI1是bin 424的42个候选基因中的一个，是bin 424中顺式eQTL的两个候选基因中的一个。此外，bin 424中五个基因表现出反式eQTL。然而，它们都不与类黄酮代谢直接相关，这表明bin 424中的mQTL是顺式作用。CHI1的表达被认为是栽培番茄果实成熟过程中黄酮类化合物生物合成的瓶颈，并且在破色期和成熟阶段间，在番茄红色果皮组织中观察到了其表达的急剧下降。
图3 野生番茄基因渐渗系mQTL定位
根据bin的基因组位置，每个bin中mQTL的分布。突出显示了mQTL热点、带注释的代谢物及其所属发育阶段。含量增加和降低的代谢物分别对称地显示在bin的上部和下部。
5.果实成熟期间防御性糖苷生物碱（SGA）组成的化学变化
在番茄中，α-番茄碱是叶片和绿色阶段的果实中的主要防御性糖苷生物碱。在番茄从绿色果实转变为红色果实的过程中，α-番茄碱都转化为七叶皂苷A及其衍生物（图4a）。α-番茄碱的代谢对于减少成熟果实的苦味是必需的，是番茄果实适合人类食用的前提条件。迄今为止，涉及这一化学转变的途径的大多数基因和酶仍然没有搞清楚。作者的mQTL数据突出显示了与α-番茄碱及其下游衍生物的变化相关的多个基因座（图4b）；指出了在番茄果实成熟过程中产生SGA的生物合成途径中的关键酶。这包括GAME31，(2-氧戊二酸依赖性双加氧酶（2-ODD），催化α-番茄素7的羟基化）和GAME5（尿苷二磷酸（UDP）糖基转移酶家族成员，介导由乙酰氧基-羟基番茄碱形成七叶皂苷A）。
图4 番茄果实成熟过程中SGA代谢途径的关键酶
a，由GAME31（绿色）和GAME5（红色）催化的SGA生物合成途径中的可能代谢步骤。b，LOD值表示代谢物积累量或GAME5和GAME31的基因表达量。上调和下调分别表示为正值和负值。c，与对照相比，GAME31沉默的红色成熟番茄果实中SGA的水平。d，与对照相比，GAME5沉默的红色成熟果实中SGA的乙酰氧基-羟基番茄碱和七叶皂苷A的水平。e，在大肠杆菌BL21（DE3）中产生的纯化重组番茄GAME5的酶法分析。
在GAME31基因的基因组位点中，S.pennellii渗入（bin 87；2号染色体）会导致羟基番茄碱增加，以及α-番茄碱水平的相应降低（图4b）。在bin87中的29个基因中，作者检测到两个编码全长2-ODD的串联基因（即GAME31和GAME31-like）和三个截短的2-ODD。在番茄果实中，基于烟草脆裂病毒的病毒诱导的基因沉默（VIGS）分析支持GAME31的活性（图4c）。为了测试QTL是否源自GAME31表达改变或其S. lycopersicum和S. pennelliiGAME31的酶活性差异，作者进行重组S.pennellii GAME31酶活性分析。酶活性测定结果表明SGA水平变化QTL可能是GAME31基因表达变化的结果（可能在启动子区域），但这仍有待进一步研究。
另一个mQTL是红色成熟番茄果实中主要的SGA七叶皂苷A的积累的遗传基础。在bin 1,006基因组位点（染色体10）渗入了野生番茄基因的番茄株系在红色成熟阶段的七叶皂苷A水平降低了十倍以上。在番茄果实成熟期间，乙酰氧基-羟基番茄碱被糖基化形成七叶皂苷A（图4a）。在bin 1,006中注释的总共30个基因中，作者检测到3个可能的UDP糖基转移酶，其中只有GAME5在破色期和橙色期之间表达上调。尽管红色成熟果实中基于GAME5的VIGS沉默导致了七叶皂苷A的没有显著降低，但乙酰氧基-羟基番茄碱（七叶皂苷A的前体）水平却显著增加（图4d）。这表明GAME5参与了乙酰氧基-羟基番茄红素向七叶皂苷A的转化。为了确定其糖基转移酶活性，作者在大肠杆菌中表达了GAME5，并用乙酰氧基-羟基番茄红素和UDP-葡萄糖进行了重组酶分析，成功合成了七叶皂甙A，为GAME5作为乙酰氧基-羟基番茄碱UDP-葡萄糖基转移酶的活性提供了有力证据（图4e）
6.成熟果实抗病相关的QTLs
使用病菌接种红色成熟阶段的果实，测量病变区域的直径，对所有番茄株系的病菌敏感性进行量化，将结果转化为Botrytis抵抗力得分（BRS）。由此可以得到每个bin渗入对番茄株系抗病能力的影响。与抗病性增加相关的QTL包括6号染色体上bin 542（包含88个带注释的基因）和9号染色体上bin 827和bin859（包含289个带注释的基因）。此外，两个QTL，18号和19号bin（包含1,669个带注释的基因），以及23号和24号bin，包含58个基因，增加了番茄株系对病菌的易感性。
7. 整合多组学数据和病菌抗性数据确定果实抗病相关因子
作者使用正则回归分析估计了每个数据集对抗病能力的贡献（图5a）。结果表明，转录组数据是番茄果实抗病性的主要预测因子（约占33％的预测贡献；图5b），其后是红色期的代谢物水平（约占7％）。破色期的代谢物水平以及渐渗位点数据仅有有限的影响（分别约为5％和3％；）。
图5 多组学数据预测灰霉菌的抗性的能力
a，灰霉菌抗性预测表示为从LASSO正规化回归模型获得的R2值的箱形图。b，各个组学的分子差异对灰霉菌抗性的贡献。
作者使用内关联加权相关分析，构建了一个与番茄抗病指数表现出相关变化的转录本和代谢产物网络（图6a）。候选转录本和代谢产物形成了两个紧密共表达的网络。与抗病性相关的网络包括110个转录本，以及主要的番茄黄酮类柚皮素查尔酮和两个类黄酮苷，以及六个未确定的代谢物。
图6 网络分析揭示了灰霉菌抗性相关基因和代谢产物
a，转录物-代谢物网络概述，其中转录物和代谢物表示为节点。图中泛酸额外标识。b，抗病指数在所有渗入的bin中的归一化平均倍数变化。c，所有bin上抗性亚网络的每个转录本和代谢产物的标准化平均倍数变化。d，在所有bin中，易感性亚网络中每个转录本和的代谢产物的标准化平均倍数变化。b和c中的线根据a中的图例进行颜色标识。
8.番茄果皮中泛酸的积累提高了抗病性
在相关网络分析中发现的六种代谢物可能是番茄抗病菌侵染的潜在新元素。因此，使用LC-qTOF-MS，重新分析了亲本S. pennellii和S. lycopersicum，以及六种代谢物含量最高的渐渗系的果实提取物。鉴定出一种候选的抗病菌代谢物是泛酸（维生素B5；图6a）。值得注意的是，泛酸仅存在于野生番茄和相应的渐渗系BIL-2387果实中，而在栽培番茄果实中却不存在。使用不同浓度的泛酸进行的感染抑制试验验证了其对病菌的抑制能力。
9.抗病候选基因的沉默导致对病菌的敏感性增加
抗性和易感性相关网络均包含一组与果实病菌抗性有关的转录本。作者分析了它们在组织和发育阶段的表达特征，以及在成熟抑制基因（rin）和不成熟（nor）突变体株系以及用乙烯信号抑制剂1-甲基环丙烯（MCP）处理引起的表达变化。结果揭示了四个主要基因表达簇的存在。果实成熟簇包括在果实发育的橙色和红色成熟阶段上调的基因。两个绿色果实相关的基因簇主要在绿色阶段特异表达。第四个簇的转录本在红色成熟阶段被高度上调。聚类分析表明，属于抗性亚网络的转录本主要在绿色期果皮和果肉组织中表达（绿色果实相关基因簇），在nor突变体中上调。然而，大多数与敏感性相关的亚网络基因是成熟基因簇的一部分，在橙色和红色成熟阶段被上调，而在rin和nor突变体中则主要被下调。
接下来，作者选择了三个潜在的抗性候选基因（ACO5，ACD2和4CL-like）进行基因沉默功能验证。结果表明，通过网络分析确定的三个基因可能是成熟番茄果实中真菌抗性所必需的。
讨论
野生番茄驯化以及随后的育种过程对果实成熟及其伴随的无数代谢过程产生了重大影响。代谢变化影响了许多具有经济意义的果实特性，包括质地、色素沉着、风味和对病原体的抗性。在这项研究中，作者通过将野生番茄基因组渗入栽培番茄，获得了高精度的研究群体，对这些群体进行转录组、代谢组和抗病性的多组学研究。作者重点研究了破色期和红色成熟期，因为这代表了野生物种和栽培品种果实间最大的代谢变化，并分析了破色期代谢产物前体的积累与其在果实成熟期间终产物之间的关系。这种关系导致作者选择对破色期样品进行转录组分析，而不是红色期。
尽管自交系种群已广泛用于精细作图，尤其是在番茄中，但作者的研究群体实现了更高的分辨率，并整合了多组学表型数据。这一研究体系展现了强大的功能，主要是发现GAME31和GAME5作为成熟番茄果实中SGA途径的核心酶。几个研究组提出了可能的途径中间体和酶，通过这些途径，在番茄果实成熟的过程中，大量的α-番茄碱转化为七叶皂苷和番茄红素苷。GAME5和GAME31增加了有关此假定途径的知识。番茄成熟过程中化学变化可能是在水果进化和驯化过程中选择的，以避免成熟水果中高α-番茄碱的积累，导致苦味。
作者的综合方法还有助于鉴定可能促进病菌抗性的基因和代谢产物，并强调了苯丙烷类化合物在果实病菌防御中的作用。虽然先前已经报道过苯丙类化合物在番茄果实对真菌感染的反应中的作用，但此处的结果表明，一组非常特殊的类黄酮与抗病性有关。在作者的研究中，芦丁（番茄中最丰富的黄酮类化合物之一），与灰霉菌的抗性无关。这项工作的结果突出了3'，5'-葡萄糖基荧光素和泛酸在对灰葡萄孢的果实抗性中的作用。泛酸是辅酶A和全酰基载体蛋白的重要前体，降低其水平可能会影响一系列下游抗病相关的代谢途径。另外，此处显示的泛酸对灰葡萄孢生长的直接影响表明，泛酸本身可作为保护性代谢产物
灰质芽孢杆菌的抗性还与病原体反应中涉及的转录本的协调变化有关。抗性子网络的基因主要在绿色果实中表达，而在nor突变体中则上调。这些基因中的许多以前据报道与病原体抗性有关。基因ACD2，ACO5和4CL-like的功能分析揭示了它们在抗灰葡萄孢的果实抗性中的作用。
本研究获得的大型数据集是科学界的独特资源。作者在在线数据浏览器（https://szymanskilab.shinyapps.io/kilbil/）中以易于访问的形式公开这些数据。虽然作者只能深入表征少数候选基因和代谢物，但该数据集可能会挖掘数十个（甚至数百个）候选物。作者预计，通过这项研究推断出的基因型与表型之间的联系将对当前的分子育种工作做出重要贡献。