编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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导读
植物矮秆突变体通常表现为生长发育迟缓、节间短、叶片和花畸形。这些突变体已被用于探索许多模式植物和作物（如拟南芥、番茄、水稻和玉米）生长发育的分子机制。此外，矮秆育种对于抗倒伏和提高产量也很重要，例如两个著名的“绿色革命”水稻品种和小麦品种。迄今为止，在植物中发现的大多数矮秆性状都与赤霉素（GA）、油菜素内酯（BR）、吲哚-3-乙酸（IAA）和独脚金内酯（SL）的生物合成或信号传导途径有关。GA是控制株高的关键因素之一；“绿色革命”小麦和水稻具有代表性，因为小麦半矮秆基因降低了株高-1和-2、Rh1和Rh2，参与GA信号传导途径，水稻半矮秆基因Sd1参与GA生物合成。研究已经令人信服地证明，BR是促进节间伸长的主要内源激素。迄今为止，许多参与BR生物合成和下游信号通路的矮秆突变体，如dwf1、dwf4、dwf7/ste1和bri1（BR不敏感）突变体在拟南芥中已经被鉴定。根据大量证据，IAA与BR类似，也是通过激活细胞伸长来决定节间伸长的主要因素。IAA转运关键基因ABCB1/PGP1在玉米突变体brachytic2（br2）和高粱突变体dwarf3（d3）中的异常表达导致了矮化类型。色氨酸依赖性IAA生物合成中CYP79B2和CYP79B3的沉默导致拟南芥生长减慢。除了上述植物激素外，还有其他因素导致植物矮秆性状，如转录因子、同源盒基因和细胞壁合成基因。因此，植物矮秆性状可能与不同途径的基因功能异常有关。在芸薹属植物中，一些研究通过转录组、激素分析等方法揭示了与矮秆相关的分子机制。甘蓝是世界上重要的蔬菜栽培品种。甘蓝矮秆病的研究还没有报道。本研究小组首先发现了一个自发的甘蓝矮秆突变体（99-198dw）它起源于自交系99-198，矮秆，叶皱，不抽穗，生育能力大大降低。为了研究99-198和99-198dw之间的表型、转录组和激素含量差异，研究者进行了细胞学观察、RNA-Seq和液相色谱-串联质谱（LCMS/MS）绝对植物激素定量分析。这一结果将有助于揭示99-198侏儒侏儒症的相关基因和途径，为候选矮秆基因的发掘和克隆奠定基础。原名：Morphological, transcriptomics andphytohormone analysis shed light on the development of a novel dwarf mutant ofcabbage (Brassica oleracea)译名：形态、转录组学和激素分析为甘蓝矮秆突变体的研究提供了新的线索DOI号：10.1016/j.plantsci.2019.1102831 矮秆突变体99-198dw和对照99-198的不同表型甘蓝矮秆突变体（99-198dw）除植株体积缩小外，还表现出多重缺陷。与99-198相比，99-198 dw具有缓慢的生长速度，表现出明显的矮化（图1a-1c，e）和枯萎的叶子（图1a），并且不能形成头部（图1b）。苗期、抽穗期和结荚期99-198和99-198dw的平均高度分别为10.75/6.81、30.37/14.75、96.63/29.63（cm）（p<0.001）。大多数花芽在开花初期开裂，花药中没有花粉粒。一些花蕾发育正常，产生有活力的花粉。然而，从99到198，突变体表现出明显的雌性育性降低，自交或花粉授粉时产生的种子很少（图1c，d）。为了观察99-198dw茎节间的细胞学差异，作者评估了99-198和99-198dw茎节间的石蜡切片（图2a，b）。99-198和99-198dw细胞的平均长/宽分别为276.56/204.41和395.37/296.26（μm），p值分别在0.01和0.05之间和<0.01之间。99-198dw的细胞体积较大，但99-198dw的细胞层数比99-198的少，这表明矮化最有可能是由细胞分裂缺陷引起的。为了研究该突变体叶片皱褶的发生，对99-198和99-198dw叶片进行了透射电镜观察。在99-198dw观察到的细胞比在99-198观察到的细胞数量少，体积大（图2c，d），在99-198dw观察到的细胞中，叶绿体降解伴随着疏松排列的基质片层，大量形成囊泡，淀粉粒减少；此外，嗜锇质体小叶消失，很少观察到线粒体（图2e，f）。99-198dw中具有更多叶绿体的图（图A1）。图1对照99-198和矮秆突变体99-198dw在苗期（a）、莲座期（b）和结荚期（c、d）的表型和（e）苗期、抽穗期和结荚期的株高。图2 节间（a，b）和叶（c，d）及叶绿体（e，f）的传递截面。a、 c和e代表对照99-198，b、d和f代表矮秆突变体99-198dw为了揭示矮化和伴随表型的机制，进行了RNA-Seq鉴定DEGs及相关GO项和KEGG途径（原始数据存入NCBI序列读取存档数据库，登录号为PRJNA562412）。在99-198dw和99-198之间共有3801个DEGs，其中上调基因2203个，下调基因1598个，p-adjust的截止条件为<0.05&| log2FC |≥1。分析了前20个显著富集的GO项或KEGG途径，如图3和图4所示。GO富集分析表明，在99-198dw范围内有不同的抗逆途径。在GO富集项（图3）中，SA和含酚化合物的生物合成途径和代谢过程在GO分析中最为富集。丰富了内质网应激反应、应激反应调节、细胞应激反应调节、天然免疫反应、免疫反应、植物型超敏反应调节、细胞死亡负性调节、MAPK级联反应等多种保护反应。此外，JA-和ABA介导的信号通路也得到了丰富。糖脂存在于各种膜结构中，如叶绿体、线粒体和内质网。鞘脂是内膜的结构成分，如叶绿体类囊体膜，通过其代谢产物作为生物过程的生物活性调节因子发挥作用，如程序性细胞死亡。在前20个富集KEGG途径（图4）中，鞘脂代谢和鞘糖脂生物合成被富集，表明99-198dw细胞的内膜受到扰动，这一结果与富集期光合作用一致，GO富集分析中的光反应和细胞学观察结果表明，叶绿体在99-198dw范围内降解。图3不同组间比较中显著富集DEGs的Venn图代表了DEGs的唯一性和重叠性3 JA、SA、ABA和ET相关的DEGs大多上调JA介导的信号途径中总共有89/110 DEGs，SA途径中有109/132 DEGs，ABA激活信号途径中有94/133 DEGs，乙烯激活信号途径中有65/79 DEGs，参与MAPK级联的48 DEGs中有39 DEGs被上调。JA在植物对逆境的反应和植物生长发育中起着重要作用。JOA生物合成中的三个关键基因，包括BOL026826（LOX2，脂氧合酶2），BOL035942（烯丙氧合酶，AOS）和BOL032586-（烯丙氧基环化酶2，AOC2）在99～1980年被上调。此外，JA介导的信号通路中的7个关键基因在99-198dw中均显著上调，包括1个JAR1（茉莉酸酰胺合成酶）编码基因Bol000924和6个JAZ编码基因：Bol026339、Bol017418、Bol026828、Bol029321、BOL01316和Bol032006。三个UDP糖基转移酶编码基因Bol029483、Bol030029和Bol030030被上调，参与SA介导的超敏反应。异构化合成酶（ICS）是SA生物合成中异构化途径的关键基因。编码ICS1、Bol026155、Bol039358和Bol039936的三个DEGs上调。ABA对不同的环境胁迫有反应。ABA生物合成中的DEGs均在99-198dw范围内上调，其中Bol011830（9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶，NCED3）和Bol029611（短链脱氢酶还原酶3a，SDR3a）催化脱落醛的产生。在ABA信号传导途径中起重要作用的基因也有显著差异表达，如ABA受体编码基因Bol017785和Bol010877（抗吡虫啉类1，PYL）和Bol020474（可能的蛋白磷酸酶2C，PP2C5），其中Bol020474在99-198dw中有特异表达。ABF编码基因Bol003614作用于ABA信号下游，在99-198dw中上调。ET生物合成和信号传导途径在发育过程中受到严格调控，并对环境胁迫作出反应。鉴定了四个关键基因，即BOL04227（1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶7，ACS7）和三个1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（COC）编码基因，BOL021740（ACCO1），BOL00 1497（ACCO5）和BOL010411（ACCO3），99～1980年16倍显著上调。在ET信号途径中编码EIN3结合F-box蛋白2（EBF2）的两个DEGs，Bol022360和Bol036169被上调。鉴定了4个ET反应性转录因子（ERF）编码基因Bol036174、Bol011876、Bol004643和Bol028757，其中2个基因上调，2个基因下调。总之，在99-198dw中，JA-、SA-、ET-和ABA相关基因的变化主要与胞质分裂缺陷有关。4 与GA、BR、IAA和SL的生物合成和信号传导途径有关的关键DEGs大多下调以往的研究表明，GA、BR、IAA和SL的生物合成过程和信号转导通常与株高有关。此外，转录因子、同源盒基因和细胞壁合成基因也被报道用于控制株高。作者鉴定了DEGs，以分析与GA、BR、IAA和SL相关的基因是否与99-198dw的侏儒症相关。乙烯是重要的植物激素，特别是促进细胞分裂和伸长的功能，以及GA生物合成中关键酶的功能失调，如耳鼻果酸氧化酶（KAO）、GA3氧化酶（GA3ox）、ENT二磷酸二磷酸合酶（CPS）、恩贝壳杉烯合酶（KS）、恩特贝壳杉烯氧化酶（KO）和Ga 2-氧化酶（GA2ox），结果矮小突变体。共有25个DEGs，其中10个基因下调，15个基因上调，参与了GA的生物合成过程、GA介导的信号途径和对GA的反应（表A.2）。GA生物合成中的关键基因Bol040956（KAO1）和Bol038154（GA3ox）以及GA介导的信号通路中的Bol030416（GASA14，赤霉素调节蛋白）均受到下调。其中Bol018149（-1.521，1.36E-11）与细胞板和叶片形态发生有关，对99-198和99-198dw之间的差异似乎很重要。BRs调节植物的生长和发育，其突变体通常表现出严重的生长缺陷和降低的肥力。在这项研究中，53个DEGs参与了BR生物合成过程的调节、BR介导的信号传导途径以及对99-198dw中BR的反应，大多数基因下调，log2FC的范围为-3.703至-1.004。其中，编码BR生物合成关键酶CYP90C1（Bol018666）的基因和参与BR介导的细胞分裂信号通路的关键基因均下调，包括BR不敏感1-5（BRI1-5，Bol030178）、BR不敏感2（BIN2，Bol024417）、BR信号激酶（BSK，Bol008466和Bol011497）和Cyclin-D3（CYCD3，BOL013635，其中BOL030178在99—1980年显著降低约10倍。另外，参与植物型细胞壁生物发生的deg还包括Bol004821、Bol039291、Bol027708、Bol042518、Bol037895、Bol018140和Bol013635，其中Bol039291是细胞大小的调节因子。Bol013635在BR介导的细胞分裂信号下游区域发挥作用，在99-198dw中显著下调13倍。IAA是一种著名的植物激素，对促进茎的伸长有很强的作用。在99-198dw范围内发现14个与IAA相关的DEGS。在这些DEGS中，三个IAA编码基因（BOL025763、BOL018356和BOL019603）和参与IAA介导的信号的三个DEG，即GH3（吲哚-3-乙酸酰胺基合成酶：BOL013052和BOL0423 27）和ARF（生长素应答因子：BOL016113），均被下调。3个参与IAA生物合成的CYP79B编码基因被上调。此外，4个IAA编码基因在99-198dw中上调。研究表明，SL通过控制细胞数量而不是细胞长度来刺激细胞分裂，从而影响干伸长。仅发现两个与SL相关的DEG。BL033658（-1.112，0.908E-3），编码SmixL2，通过调节SL应答控制幼苗生长的蛋白质，在99～1980年被下调。另一个DEG，Bol000491（1.85，1.587E-3）编码SL酯酶D14，其作为SL的受体，在抑制芽分枝中起中心作用。5 参与细胞分裂的DEGs在99-198dw时均下调从细胞学观察结果来看，作者认为99-198dw的矮化与细胞分裂有关，因此，作者研究了与细胞分裂有关的DEGs。在99-198dw范围内，32个参与细胞周期调控、细胞分裂和染色体分裂的基因被下调。肌动蛋白细胞骨架是细胞膨胀和植物形态发生的重要调节因子。Bol038948和Bol025066编码两种重要的细胞分裂蛋白，它们形成一个收缩环结构，将其他细胞分裂蛋白招募到隔膜中，在分裂细胞之间产生新的细胞壁。G2/M期和G1期的细胞比率代表细胞分裂率052，此外，在BR生物合成过程、BR介导的信号途径和对BR的反应中，也注释了6个DEG，即Bol019867（-1.552，9.968E-9）、Bol024186（-1.1，1.732E-5）、Bol033286（-1.781，6.816E-3）、Bol004875（-1.004，0.0141）、Bol029386（-1.228，9.743E-6）和Bol024417（-1.206，1.059E-4）。其中，Bol024417基因还负责叶片的形态发生和多维细胞的生长。采用同位素标记内标法对21种植物激素进行了LC-MS/MS绝对定量分析。其中，检测到13种植物激素。99-198dw的GA4显著降低，其变化倍数（99-198dw/99-198）为0.42，P值为0.05。IAA和castasterone（一种BR）的折叠变化（99-198dw/99-198）分别为1.54和1.07，但这两种激素的P值均大于0.05。对于细胞分裂素型，除反式玉米素外，异戊烯基ladenine、二氢玉米素和反式玉米素几乎没有变化，变化倍数（99-198dw/99-198）为1.56，P值为0.02。JA、ACC（ET前体）、SA和ABA含量在99～198dw范围内增加，其中SA含量显著增加，变化幅度为（99～198dw/99～198）0.42倍，P值为0.03。在LC-MS/MS绝对定量分析结果的基础上，结合前人对株高的研究，采用GA（50、100和150 mg/L）、BL（0.05、0.5和5 mg/L）、6BA（0.5、5、50和100 mg/L）和PC（100 μM，SA合成抑制剂）、SA（100 μM）进行激素处理对对照苗进行喷施，以水为模拟处理。外源施用的结果表明，99-198dw的株高和叶片形态未被挽救（图A2）。当6BA浓度≥5 mg/L时，叶片出现坏死斑点。作者随机选取16个DEGs进行qRT-PCR验证。两种方法的输入数据均为每个基因的log2FC（99-198dw/99-198）。RNA-Seq和qPCR检测的基因表达模式相同，R2为0.8701（图5），表明两种方法的折叠变化的相对表达呈高度相关。
图5：RNA-Seq与qRT-PCR检测基因表达模式的相关性分析
图6：与99-198相比，99-198dw中植物激素合成和信号转导通路的转录变化。数字16:3和18:3表示不同的多不饱和脂肪酸，而上下调节的基因表达模式则分别被分为红色和绿色。在本研究中，作者通过RNA-Seq、LC-MS/MS和激素处理，探索了从甘蓝自交系99-198中发现的99-198dw突变体矮秆矮化的分子机制。根据研究结果和讨论，作者绘制了一个示意图（图6）。研究结果如下：（1）与SA、JA、ABA和ET相关的关键基因均上调，这些植物激素在99-198dw范围内参与叶绿体降解和胞质分裂缺陷等逆境抗性；（2）与IAA相关的关键基因下调，BR和GA参与了99-198dw矮秆表型的形态发生；（3）细胞分裂缺陷是矮秆发生的主要原因。这些结果为阐明99-198dw侏儒症的分子机制提供了依据，为候选矮秆基因的鉴定奠定了基础。植物矮秆突变体一般表现为生长迟缓、发育迟缓、节间短、叶片和花畸形等，是探索植物生长发育分子机制的理想材料。在目前的研究中，首先发现了一个自生甘蓝（Brassica oleracea）矮秆突变体99-198dw，与野生型99-198相比，该突变体矮小、叶片皱褶、不抽穗、自育性显著降低；然而，其矮秆的潜在分子机制尚不清楚。本文对99-198和99-198dw之间的表型、转录组和植物激素进行了比较分析。细胞学分析显示，在99-198dw范围内，细胞体积增大，细胞层数减少，叶绿体降解，线粒体减少。RNA序列分析表明，共鉴定出3801个差异表达基因（DEGs），其中矮秆突变体上调基因2203个，下调基因1598个。抗逆途径中的关键基因大多上调，包括水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、乙烯（ET）等，而DEGs与株高有关，如赤霉素（GA）、油菜素内酯（BR）、吲哚-3-乙酸（IAA）等， SL途径主要是下调的。此外，细胞分裂途径中的DEGs均下调，这与细胞学检测的胞质分裂缺陷相一致。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）绝对定量法测定GA4、JA、ET、SA和ABA含量的变化与转录组分析结果一致。进一步的激素处理试验表明，外源GA、BR、6BA、多效唑（PC）等激素处理不能挽救矮秆性状的表现型，说明激素的变化是矮秆性状产生的原因，而不是矮秆性状产生的原因。推测某些DEG的突变与细胞分裂有关，或参与GA、BR、IAA、SL等植物激素的信号传导途径，是矮化的原因。这些结果为阐明99-198dw中潜在的调控网络提供了信息，丰富了在分子水平上对植物矮秆性状的认识。
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