编译：YQ，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
玉米（Zea mays）是世界三大谷类作物之一，然而玉米产量易受病虫害影响，包括黄曲霉菌（Aspergillus flavus）等真菌。黄曲霉是一种机会性致病菌，属于死体营养型，导致宿主细胞死亡并以坏死组织为食。黄曲霉可感染多种作物包括陆地棉、花生、甜杏仁，其产生的黄曲霉毒素是潜在致癌物，因此黄曲霉污染的作物收到法律严格限制。目前研究通过玉米-黄曲霉在多个方面的互作确定了影响作物产量降低的因素，大量研究针对黄曲霉菌的重要生命周期基因（VeA、LaeA）。先前研究表明脂肪氧合酶基因是玉米-黄曲霉的互作的关键基因，黄曲霉的类泛素化修饰基因PdeH在互作中发挥重要作用。近年来有关抗黄曲霉玉米的研究集中于单一基因组方法（如DNA-seq、RNA-seq），这些技术识别了关键的抗病基因如PR10/5、几丁质酶、胰蛋白酶抑制剂，关键通路如茉莉酮酸酯、乙烯生物合成。目前研究黄曲霉-玉米互作的限制是分别分析病原和宿主的数据，为了更好地理解互作关系，本研究采用互作转录组对黄曲霉-玉米进行分析。实验设计基于高密度时间序列转录组，预测基因调控通路的相互关系，并识别感染早期活跃的关键通路，构建基因调控网络（GRN）以反映跨物种通路的基因调控关系，描述了感染早期阶段的玉米-黄曲霉分子互作的潜在遗传学。
原名：Use of Dual RNA-seq for Systems Biology Analysis of Zea mays and Aspergillus flavus Interaction
译名：互作转录组揭示玉米与黄曲霉菌的相互作用
期刊：Frontiers in Microbiology
IF：4.235
发表时间：2020.06
通讯作者：Bryan Musungu
通讯作者单位：南伊利诺伊斯大学植物生物学系
DOI号：10.3389/fmicb.2020.00853
① 实验材料。玉米自交系B73种植于北卡罗莱纳州立大学的中央作物研究站。黄曲霉菌（A. flavus NRRL 3357）于PDA培养基生长。病菌注射接种8株玉米中，在接种后0-144h（采集18次，SI1-18）采样。样品-80℃液氮冻存。
② 互作转录组测序。提取玉米谷粒RNA，构建cDNA文库并测序。CLC workbench对序列进行比对可视化，DESeq进行差异表达基因分析，K-means法聚类分析。
③ 基因调控网络（R GeneNet）。选择差异显著的基因进行相关性分析，cytoscape进行网络可视化，设置有向箭头显示基因间的调控关系。
本研究用黄曲霉分生孢子悬浮液注射玉米籽粒，在不同时间采集籽粒提取RNA进行测序，进行基因表达水平分析。在感染早期，每个样品的RNA多数属于玉米宿主，因为刚接种时病原细胞数量少，且生长缓慢，而感染后期黄曲霉RNA比例增加。因为所有RNA样本的测序总量相同，所以宿主RNA比例随时间减少表明黄曲霉在感染后期造成植物组织坏死，并增加菌丝浓度。本研究通过不同时间采样比较黄曲霉的侵染阶段，图1显示不同感染阶段黄曲霉的转录活性，MA-plot图显示相对定量值（log2 fold change）和绝对定量值的偏差，确定各样品的总体表达水平和差异表达基因。黄曲霉感染早期的转录本（SI1-6）由于reads较少不做分析。随时间推移，感染表型有明显变化，尤其在接种后12-42h。由于接种感染的时期不能完全等同于病菌的侵染阶段，于是本研究采用一个指标（黄曲霉和玉米中各自特异的转录本比值）作为侵染阶段的标准，结果将样品分成18个感染阶段（SI1-18）。这种标准显著降低生物学重复间的转录本差异，根据这种感染阶段标准的MA-plot图可明显看出相对侵染早期，后期的基因表达差异十分明显（图2）。按时间顺序排列的样品在接种后4h玉米基因表达有显著差异，而根据感染阶段排列的样品SI2-4只有36个基因差异表达。导致时间顺序排列和感染阶段排列差异的原因可能是病菌接种后的存活率差异，使得一些病原接种样品较早进入侵染的晚期阶段。当按照时间顺序排列样品进行主成分分析时生物学重复间均有一定差异，而按感染阶段分组后感染后期（SI7-15）的样品聚集紧密（图3），进一步分析发现SI7和SI8的差异表达相似，这是病原开始显著增殖的两个阶段。之后，本研究依据感染阶段（SI）对玉米转录本进行差异表达分析。在黄曲霉感染初期病原RNA含量极低，而SI3时期玉米有7个显著差异表达的基因，SI6时玉米出现大量差异表达基因，同时发现黄曲霉多个耐药基因表达。SI2时期只有一个基因（GRMZM2G175574）差异表达，表明这时玉米对病原缺乏响应。在SI18时期，2345个玉米基因显著上调，4057个基因下调，其中许多基因与病原抗性响应相关。
图1 黄曲霉菌转录本差异表达值的MA-plot，SI7感染阶段作为对照。A：SI8相对SI7的差异表达；B：SI18相对SI7的差异表达。红色表示差异显著。
图2 玉米侵染早期和晚期转录本差异表达值的MA-plot，显示基因表达差异倍数变化的分布。A：SI2相对SI0的差异表达；B：SI18相对SI0的差异表达。
本研究利用GO富集分析揭示玉米-黄曲霉互作基因的功能途径。富集分析发现许多基因与植物抗性相关，包括胚胎后期富集蛋白基因（GRMZM2G072890）、蔗糖合酶基因（GRMZM2G008507）、几丁质酶相关基因等。在SI9时期，235个基因差异表达，包括病原响应中的苯二甲酸还原酶基因（GRMZM2G156712）、茉莉酸生物合成基因、内切几丁质酶基因等。SI10时期和SI18时期有60个抗性基因共表达，包括几丁质酶、谷胱甘肽s-转移酶、1-氨基环丙烷-1羧酸盐合成酶基因。GO富集分析发现SI18时期多种抗性途径，上调的基因有内切几丁质酶（GRMZM2G051943）、冠菌素抗性蛋白（GRMZM2G151536），有些基因与氧化还原过程、氧化还原酶活性、单加氧酶活力有关。SI18时期有1890个基因在其他时期无表达，但这些基因在功能上没有显著富集。SI18与SI19时期共表达的15个基因与植物抗性相关，而病原感染后期的多数基因与应激反应和次生代谢物合成有关。在SI18时期，出现了下调通路，包括脂肪氧合酶、病程相关蛋白、几丁质酶基因，这些基因与信号转导相关。虽然感染早期只能检测到黄曲霉少量的转录本，但这些转录本均为真菌中的保守基因。比如SI1时期检测到黄曲霉的伸长因子EF-1基因（AFLA_090780），这个基因在所有SI中高表达且没有差异，是良好的标记基因。在SI8至SI18时期，黄曲霉的多数差异表达基因为上调表达（图4），SI8时期有157个上调基因和2个下调基因，富集于初级代谢，包括羧酸代谢过程、单羧酸代谢过程。SI9时期的基因富集为氮代谢（氮化合物代谢、蛋白质水解、细胞氮化合物生物合成）。SI10时期开始有大量的差异表达基因，其中毒素基因簇显著上调，基因富集途径为发育过程、内吞作用、酮酸代谢。本研究利用K-means法对差异表达基因进行聚类。聚类发现玉米防卫基因、AP2/EREBP转录因子、过氧化物酶的共表达。玉米中的一个基因簇的表达模式是感染初期表达上调而后期表达下调，这个基因簇可能与病菌耐药性或毒素早期响应有关。至于黄曲霉菌，多个基因簇属于初期上调后期下调，这些基因涉及氧化磷酸化途径（图5）、RNA运输、核糖体生物合成（图6）。聚类分析发现有一个基因簇在感染中期高表达，这些基因包括黄曲霉的水解酶基因（果胶裂解酶、果胶裂解酶前体、果胶酯酶前体）和玉米的果胶酯酶基因。聚类分析发现黄曲霉毒素基因（AflR、AflR、AflR）共表达，但所有毒素基因分散在多个簇中，且玉米的茉莉素生物合成基因、查耳酮合酶、AP2/EREBP转录因子、多个活性氧结构域基因与毒素基因共表达。本研究利用KEGG分析不同感染阶段的转录本数据，发现SI6时类黄酮生物合成基因和谷胱甘肽代谢途径基因显著富集（图7）。SI5时期氨基酸代谢基因富集，SI14时期茉莉酸代谢基因富集，SI9时期次级代谢产物生物合成、氨基酸生物合成和碳水化合物代谢等途径显著富集，SI10时期黄曲霉毒素途径、氧化磷酸化途径、RNA转运途径显著富集。在感染早期中显著富集的一条途径是核糖体生物发生途径，但这个途径在感染后期不富集。
图5 不同感染阶段的黄曲霉表达基因的KEGG通路分析。
图6 通过基因表达差异显著性对KEGG通路进行层次聚类分析，识别参与互作的通路。红色为差异显著基因，黄色为无差异表达基因，蓝色线条表示聚类强度。
图7 SI6时期玉米表达基因的KEGG分析。A：谷胱甘肽通路；B：类黄酮途径。本研究通过玉米和黄曲霉的差异表达基因推测病原-宿主的相互作用。依据互作转录组数据，在玉米中推测互作蛋白1451个，包括蛋白-核糖激酶、苏氨酸蛋白激酶，转录因子UNE12等，最大的互作网络产生于SI18时期，许多基因与活性氧途径、热休克蛋白、茉莉酸途径相关。至于黄曲霉，预测互作蛋白3584个，包括黄曲霉毒素基因，互作中涉及碳水化合物和氮代谢途径。本研究利用R GeneNet构建玉米-黄曲霉基因共表达网络（图8）。为确定网络中的关键基因，挑选耐药相关基因或根据基因组注释进行分析。网络中包含47801个基因，首先根据差异显著性进行筛选，然后选择基因组注释中的抗性1标记基因和转录因子基因。结果显示黄曲霉中的重要基因主要为内吞作用的基因。而玉米中的翻译起始因子SUI1为关键基因，该基因在SI9编导，但感染后期未表达。网络中的转录因子包括WRKYs、AP2、MYB、NAC转录因子，其中WRKY是关键转录因子家族，在植物抗病中广泛研究。网络中的黄曲霉毒素抗性相关基因66个，关键基因为GRMZM2G162233（无注释），与NAD(P)H基因同源，通过网络分析可推断其中56个抗性基因的调控关系（图9）。
图9 基因共表达网络推断83个关键基因的调控关系。灰色表示黄曲霉毒素抗性相关基因，蓝色表示全基因组关联分析中的黄曲霉相关基因。本研究利用互作转录组的方法揭示玉米和黄曲霉复杂的互作关系（图10）。试验中对每个样品的主成分分析表明样本在复杂因素下误差较大，因此采用感染阶段（SI）划分样品，这个值由转录本中黄曲霉的reads比例决定。研究中检测到黄曲霉的转录本差异较大，从158到11961个基因不等，这是由于早期侵染时病原浓度较低。黄曲霉毒素基因簇中的基因表达模式各不相同，因此无法在共表达网络中发现明显的黄曲霉毒素基因簇，可能由于黄曲霉毒素途径受温度、PH、碳水化合物的影响。SI9时期观察到许多基因表达途径的改变，包括淀粉/蔗糖代谢、氧化磷酸化途径，且这些基因在SI18时下调，这种变化可能是由玉米抗性基因引起的。同时，本研究显示了WRKY转录因子的重要性。WRKY转录因子在植物生物/非生物胁迫中广泛研究，本研究发现WRKY诱导茉莉酸途径基因和热休克蛋白的表达。互作转录组的方法通过多种转录本确定了，这些信息将有助于提高对黄曲霉耐药性的研究。然而，转录本数据无法对每个基因进行验证分析，即使许多基因差异显著性不高，但可能在调控中发挥重要作用。因此，本研究提供了一个全面的植物-病原体互作转录本系统，为后续基因研究奠定基础。
本研究利用互作转录组同时对玉米和黄曲霉的转录本进行分析，并对宿主-病原共表达的基因进行分析，确定了玉米在受感染过程中的关键途径：茉莉酸、乙烯和ROS途径；黄曲霉侵染过程的关键途径：黄曲霉毒素、碳水化合物代谢。同时，研究揭示了玉米抗性基因对黄曲霉基因表达的影响，为后续玉米-黄曲霉的互作研究奠定基础。
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