科研 | Journal of Hepatology：血吸虫miRNA通过靶向转化生长因子β受体Ⅲ促进宿主肝纤维化（国人作品）
编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：A schistosome miRNA promotes host hepatic fibrosis by targeting transforming growth factor beta receptor III
译名：血吸虫miRNA通过靶向转化生长因子β受体Ⅲ（TGFBR3）的促进宿主肝纤维化
期刊：Journal of Hepatology
发表时间：2019年10月
IF：18.946
通讯作者：潘卫庆&张冬梅
作者单位：上海第二军医大学
实验设计
用RNA测序法检测日本血吸虫(sja-miRNAs)的miRNAs在肝星状细胞(HSCs)中的表达，将sja-miRNAs模拟物转染到HSCs中，对sja-miRNAs进行筛选。sja-miR-2162在肝纤维化中的作用被评估通过上调其在小鼠中的表达或通过给药（rAAV8）抑制其在小鼠中的表达。
结果
图1 过表达sja-miR-2162可造成小鼠肝纤维化
图2 sja-miR-2162抑制血吸虫所引起的肝纤维化
为了研究sja-miR-2162在激活HSCs中的作用，研究者首先构建了表达sja-miR-2162的重组质粒。为了确定动物细胞是否能将嵌合体pri-sja-miR-2162加工成成熟的sja-miR-2162，研究者构建了携带萤火虫荧光素酶（Fluc）报告基因和海肾荧光素酶（Rluc）基因的sja-miR-2162传感器质粒（称为“传感器质粒”），该基因由sja-miR-2162靶位点的三个拷贝调控（原文图S4A）。两种质粒共转染293T细胞，Rluc/Fluc活性比值反映sja-miR-2162的生物活性。研究发现，与对照组相比，在没有表达质粒的情况下，Rluc活性降低（原文图S4B）。相反，与高浓度的表达质粒共转染导致Rluc活性降低，表明表达质粒在细胞系中产生成熟的sja-miR-2162，该细胞系通过靶向该miRNA的位点抑制Rluc基因的表达, 重要的是，将表达质粒转染到不同HSCs细胞系，如人、大鼠和小鼠HSCs显著上调Col1α1, Col3α1, and α-Sma的表达，表明sja-miR-2162在体外促进了HSCs的活化和胶原及ɑ-Sma的产生。
为了研究sja-miR-2162的表达是否能诱导小鼠肝纤维化，研究者使用了高嗜肝性重组腺相关病毒血清型（rAAV8表达pri-sja-miR-2162或乱序的-miRNA（SCR对照），将载体或PBS分别注射小鼠。在注射rAAV8-pri-sja-miR-2162后的40和100天，小鼠肝纤维化发生，与用SCR对照或PBS（图1B和1C）注射的小鼠相比，其特征是羟脯氨酸含量和纤维化相关基因的表达显著升高。Massons染色显示，细胞外基质（ECM）的沉积在注射后100天显著增加，但在注射40天后没有增加。进一步分离原代HSCs，检测Col1α1, Col3α1, α-Sma, Col4α1和Timp1 基因的表达。试验数据显示，与对照组相比，rAAV8-pri-sja-miR-2162注射小鼠的HSCs中所有这些纤维化基因的表达显著增加。这些结果表明sja-miR-2162在体内促进了肝纤维化。
接下来，研究者从小鼠中分离出原发性HSCs，以量化HSCs活化标记物的表达，并发现胶原、 α-Sma与注射对照载体或PBS的小鼠相比，注射海绵载体的小鼠的HSCs中的Timp1基因显著降低。为进一步验证sja-miR-2162在HSCs中的内化和促进纤维化，研究者还在感染后49天从感染小鼠中分离出原发性HSCs，并用sja-miR-2162抑制剂进行转染。结果显示，与阴性对照组（NC）相比，抑制剂显著降低了受感染HSCs中胶原、 α-Sma和Timp1的表达（图2H）。这表明抑制剂抵消了受感染HSCs中的sja-miR-2162，从而抑制了炎症相关基因的表达。这些数据表明，在血吸虫病发病过程中，寄生虫分泌的sja-miR-2162可以进入HSCs的胞浆，促进HSCs的活化和肝纤维化。
到目前为止，研究数据显示sja-miR-2162存在于宿主HSCs中，并在肝纤维化中发挥作用。接下来，研究者继续研究了血吸虫miRNA是如何传递到HSCs的。先前的研究显示血吸虫卵源性外泌体是高丰度的sja-miR-2162。基于这一发现，在本研究中，研究者分离了卵源性外泌体，并将其与来自小鼠的原代HSCs孵育。结果显示，外泌体促进了HSCs的活化，如胶原和 α-Sma的表达，而转染sja-miR-2 162抑制剂的HSCs部分阻断了外泌体介导的HSCs活化的作用，与NC相比，胶原和 α-Sma的表达显著减少。这些发现表明sja-miR-2162可能通过外泌体转运到HSCs的胞浆中。
图4 TGFBR3通过抑制SMAD信号阻断HSCs的激活
为了研究sja-miR-2162与Tgfbr3的关系，研究者首先分析了其在感染小鼠HSCs中的表达。结果发现，在感染期间，宿主HSCs中的sja-miR-2162的表达显著升高，并且在感染后40天达到高峰，相反，在感染期间，Tgfbr3 mRNA的表达显著降低，并且在感染后40天达到最低水平，这些研究表明sja-miR-2162和Tgfbr3 mRNA的表达呈负相关关系。为了检测Tgfbr3是否是sja-miR-2162的直接靶点，研究人员构建了一个携带萤火虫荧光素酶基因的载体，该载体融合到Tgfbr3 mRNA的3’UTR上，其中包含sja-miR-2162的假定靶点。293T细胞被该载体和sja-miR-2162模拟物或NC转染。结果表明，转染sja-miR-2162-mimics的细胞中的荧光素酶活性明显低于转染NC的细胞。相比之下，Tgfbr3 3’UTR的种子序列结合的5个核苷酸突变导致抑制完全消失。此外，用sja-pri-miR-2162表达质粒转染未感染小鼠的HSCs显著降低了Tgfbr3 mRNA和蛋白质的表达，而通过其抑制剂使受感染HSCs中的sja-miR-2162显著增加了Tgfbr3 mRNA和蛋白质的表达。实验还发现，用海绵载体处理的感染肝脏的原发性HSCss中Tgfbr3 mRNA和蛋白质的表达明显高于用对照载体处理的感染肝脏的HSCs。这些数据表明Tgfbr3是sja-miR-2162在宿主HSCs的直接靶点。
讨论
本研究首次证实了寄生虫miRNAs在感染期间参与了血吸虫病相关肝纤维化的形成，其证据如下：（1）宿主HSCs中存在一种寄生虫特异性miRNA，sja-miR-2162，它通过靶向Tgfbr3基因促进宿主HSCs的活化；（2）通过将sja-miR-2162导入未成年小鼠肝脏促进体内肝纤维化；（3）通过降低胶原和ɑ-sma的产生有效和持续抑制sja-miR-2162减轻了感染小鼠肝的纤维化；（4）通过转染sja-miR-2162抑制剂减少纤维化相关基因的表达通过卵源性外泌体进入感染小鼠的HSCss或体外激活的HSCsS。因此，这些数据证明sja-miR-2162在血吸虫感染过程中直接调节HSCss的活化，除sia-mir-2162外，感染小鼠HSCs中还存在sja-Bantam和sja-miR-1等多种能促进HSCs体外活化的寄生虫miRNA，这些都值得进一步去研究。
阐明引起肝纤维化的机制是血吸虫病几十年来的主要研究目标。肝血吸虫病是一种免疫病理性疾病。卵子抗原诱导的2型免疫应答被认为是血吸虫病疾病进展的中心调节因子。此外，免疫应答过程中释放的促纤维化细胞因子，如IL-13和TGF-β1，可以通过SMAD途径促进HSCss的活化和肝纤维化。本研究在已报道的研究结果的基础上，进一步的研究发现，除了促生长的胞质分裂因子外，血吸虫miRNA sja-miR-2162还以跨物种的方式直接促进肝纤维化的发生。本研究所鉴定的sja-miR-2162是一种寄生虫特异性MIRNA，在日本血吸虫生命周期的各个阶段都高度表达，并在感染小鼠的肝组织和血清中检测到。因此，研究人员得出的实验数据为肝血吸虫感染的病理机制提供了新的见解，它扩展了广大研究者对病原体衍生的miRNA在其他传染病（如寄生虫病和真菌病）病理机制中的作用的理解，特别是其中参与的病原体分泌的miRNAs，促进各种疾病发生，如纤维化。因此，病原体衍生的miRNAs可能是一类在感染性疾病病理过程中起重要作用的通用调节因子，AAV8介导的对这些病原体衍生的miRNAs的有效和持续抑制可能是一种很有前途的治疗措施。
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