科研 | BMC GENOMICS：转录组和差异分析研究雌性桡足类柱形宽水蚤存活率
编译：夕夕，编辑：景行、江舜尧。
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背景：桡足纲动物是远洋食物的基本组成部分，但是关于其自然种群繁殖的分子基因报道仍然很少。作者通过转录组分析研究了地中海那不勒斯收集的雌性桡足类柱形宽水蚤，该物种在浮游动物中占主导地位。对连续几周收集的成年雌性进行了转录组测序和差异分析。作者旨在检测可能影响自然种群中桡足纲繁殖潜能且其表达可能受到浮游植物来源的脂环素影响的关键基因，脂氧化酶的相关产物会显著影响桡足纲幼虫的存活。
结果：采样日期的温度、盐度、pH和氧气都保持一致，同时观察浮游植物细胞浓度，脂蛋白浓度和硅藻细胞中脂蛋白含量的变化。5月23日，幼虫存活率为25%，5月23日为93%。转录组从头组装得到268665个转录本和120749个基因，其中50%具有注释功能。在两个采样日期差异表达的转录本共有331个，其中119条序列进行了功能注释。共有144个差异表达基因，注释了31个。大多数显著下调的基因是A5假定气味结合蛋白，其他差异表达基因与发育代谢过程，蛋白质泛素化和应激反应有关。采用qRT-PCR对转录组分析结果进行了验证。
论文ID
原名：RNA-Seq and differential gene expression analysis in Temora stylifera copepod females with contrasting non-feeding nauplii survival rates: an environmental transcriptomics study
译名：转录组和差异分析研究雌性桡足类柱形宽水蚤存活率
期刊：BMC Genomics
IF：3.594
发表时间：2020年9月
通讯作者：Ylenia Carotenuto
通讯作者单位：Stazione Zoologica Anton Dohrn
DOI号：10.1186/s12864-020-07112-w
实验设计
结果
关于非生物(温度、盐度、pH和氧气)、浮游植物和氧脂素在两个选定日期的变化的信息见表1。非生物变量在两个采样日期之间没有显示出很大的变化而浮游植物群落丰度和组成有更明显的变化。T检验的结果表明,使用早期数据评估幼虫存活率（25%和93%）见图1。
表1. 非生物变量，浮游植物组成和氧脂素。2017年5月23日和30日在lelt - mc测量的环境变量、浮游植物丰度和组成、羟脂素浓度和羟脂素/硅藻细胞(羟脂素/硅藻细胞)含量。总体而言，5月23日浮游植物浓度(14.74 106 cells/L)低于5月30日(17.64 106 cells/L)。同样，5月23日(202.82ng/L)的羟脂素浓度也高于30日(173.47ng/L)。
图1.桡足类柱形宽水蚤反应。在两个采样日期，测量了成年雌性的平均粪便颗粒和产卵量及平均卵孵化成功率。通过T检验分析差异。
2 转录组从头组装和功能注释
对两次采用的幼虫提取RNA，并进行建库测序。过滤后，共产生132Mreads。使用Trinity软件对测序数据进行了从头组装共得到268665条isoforms，包含120749个unigenes。对isoforms和unigenes进行了功能注释。
Blast2Go结果显示，大概10%的匹配unigenes与非冗余蛋白数据库中的相似序列具有很高的同源性。总体而言，超过42%的序列具有很高的同源性。Blast2Go注释结果显示，在62,648个unigenes中，有31,346个得到了功能注释(50.04%)。共有126358条GO terms分配到生物过程(BP, 36.77%),分子功能(MF, 35.57%)和细胞组件(CC、27.66%)中(图2)。大多数unigenes注释到代谢和细胞过程(29%)、绑定和催化活性(分别为32.55%和49.59)和细胞或细胞部分(20%)。
图2.GO注释分析。共有3个GO大类分别为生物过程、分子功能和细胞组成。
3 差异表达分析和转录组验证
表2.差异表达基因。
为了进一步分析基因功能，作者对isoforms进行了差异表达分析。其中差异表达的isoforms共有331条，下调199条，上调132条。有119条序列进行了GO注释。总体来说，主要分为GO三大类其中BP和MF比例类似，CC比例较小（图3）。有趣的是，一些GO terms的isoforms在23日显著上调或下调（图3）。在BP子类中，参与ATP代谢，细胞通讯，细胞响应刺激，细胞定位的通路的isoforms下调表达。与此相反，参与分解代谢过程，细胞组分等过程的isoforms上调表达。
图3 .差异表达isoforms的GO注释。GO功能三大类分别为生物过程（BP），分子功能（MF）和细胞组分（CC）。上调isoforms用蓝色表示，下调isoforms用红色表示。
对5月23日和5月30日的unigenes和isoforms进行聚类分析见图4。5月23日，大多数显著下调的unigenes和isoforms被注释为A5假定的气味结合蛋白。其他下调的unigenes被注释为与发育代谢过程(涉及几丁质和胶原)、蛋白质泛素化、应激反应(主要是热休克蛋白70)、氧化还原反应和水解酶活性等功能。同样，其他下调亚型参与呼吸、蛋白质结合、跨膜运输和细胞发育。显著上调的unigenes和isoforms主要参与生殖、细胞发育和增殖、跨膜转运和受体活性。基于这些结果，选择了9个unigenes和3个isoforms进行RT-qPCR验证，引物见表3。其结果与转录组测序结果一致（图5）。
图4. 差异unigenes的聚类热图。列举类表明样本相似性，行聚类表明基因相似性。
表3.用于RT-qPCR验证的unigenes和isoforms。
图5. 转录组和RT-qPCR结果比较。蓝色代表RNA-seq，黄色代表RT-qPCR。
讨论
传统上，在野外和实验室研究中，通过估算早期生活史变量，如卵产率、孵化成功率和非取食(NI/NII)无节节的存活率，可以推断桡足动物种群的潜力。从这个角度来看，了解哪些分子机制有助于生物生存能力，可能有助于预测自然桡足动物种群的生殖反应。特别是，作者的差异分析可能有助于阐明从那不勒斯湾(GoN)自然种群中采集的雌性桡足纲柱形宽水蚤存活能力的分子机制。有关环境变量、浮游植物群落组成和丰度、每升氧脂素浓度和每硅藻细胞氧脂素产生的信息，可以阐明这些变量对雌性同足动物的分子反应和最终的无节虫生存能力的影响。
本研究的转录组分析产生了268,665条isoforms和120749个unigenes，这些数字明显高于其他桡足类动物。相反，作者的结果更接近于C. finmarchicus的结果。在本研究的转录组分析中，BLAST比对的前20种的物种中绝大多数是甲壳类动物，而前两种最受欢迎的物种是桡足类广腹足目和太平洋美洲鳄。尽管，只有近50%的isoforms和unigenes在BLASTx中比对上，约25%的这些序列得到了GO注释。如此低的百分比表明，尽管目前的结果表明从以前的从头转录分析中得到了改进，但改善桡足类的基因组资源仍需要付出很大的努力。
在描述了从头转录组组装和注释之后，作者验证了差异分析是否可以帮助推断参与无节细胞存活的母体相关分子过程。作者比较成年雌性产生高度可行的无节幼虫(5月30日)与雌性产生无节幼虫存活率较低(5月23日),发现差异表达序列主要是参与信号感知和转导以及生殖和发育过程。
更特别的是，大多数在5月23日被下调的转录本都是公认的气味结合蛋白。其中大部分为A5结合蛋白。气味结合蛋白(Obps)是节肢动物嗅觉系统的一部分，在黑腹果蝇模型中广泛存在。在这种生物中，Obp表达的抑制介导了一种固定的行为反应和对苦味剂摄入的调节。这些结果支持了果蝇中Obps参与有害化学物质的检测。事实上，Obps被发现介导果蝇对植物毒素的消极反应，因为Obps 57d和57e允许识别植物衍生的己酸和辛酸。在D. melanogaster中，作为对嗅觉刺激的反应，Obp调控突出的一个最重要特征是Obp基因的表达是组合的。这意味着对气味刺激的反应是由多个obp的表达来调节的。
相对于D. melanogaster中Obp调控的广泛功能信息，据作者所知，这是第一次在桡足类动物中报道这些序列的差异表达。RT-qPCR结果证实了桡足类柱形宽水蚤雌虫A5 Obp的下调，可能对5月23日摄食有害猎物和低繁殖产量起相关作用。这些结果表明，Obps可以代表重要的靶基因和蛋白质，以研究桡足类动物如何对浮游植物来源的化学物质作出反应。
低存活率也可能与丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A (Ppa2)的下调有关，因为这种酶在调节细胞凋亡方面的重要作用。丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶，如PP1、PP2A和PP2B，介导Bcl-2/ bcl - x相关死亡促进因子(BAD)的去磷酸化，这是一种促凋亡蛋白，从而导致细胞死亡。PP2A活性可由磷酸二酯酶(PDEs)调控，PDEs通过调节cAMP水平抑制PP2A活性，影响排卵前卵泡的卵母细胞垫化和卵母细胞的减数分裂。正如作者的差异分析，Pde下调，这一反应可能导致更高的cAMP水平和更强的刺激Ppa2作为补偿性机制来重新平衡失调的凋亡。
直接参与生殖和发育过程的差异表达序列也可能在分子水平上显示出宽水蚤存活率的巨大差异。甲基四氢叶酸脱氢酶(Mthfd)是上调的转录本。叶酸单碳代谢在动物的发育和疾病反应中起着重要作用。食物的代谢是复杂的，因为它涉及到几种酶的活性。有效的叶酸形式是四氢叶酸(THF)，它是参与胸苷酸、嘌呤、甘氨酸、丝氨酸和同型半胱氨酸生物合成的辅助因子。从这个角度来看，Mthfd表达的改变可能有助于解释作者研究中宽水蚤最终繁殖成功的障碍。
5月23日收集的T. stylifera中其他与细胞发育和繁殖相关的序列上调，如me31b、Vldlr和Vasa。这些基因在生殖细胞形成中起关键作用，也在卵母细胞发育和分化中起关键作用。
差异分析也暗示了蛋白内吞作用和多糖降解功能的改变，作者推测这可能是5月23日观察到的低无节细胞活性的原因。在这些序列中，Ap-2表现出显著的下调。Ap-2参与网格蛋白依赖的内吞作用，蛋白质被网格蛋白(CVV)包围成囊泡。因此，Ap-2与核内体和溶酶体系统都有密切的关系，对基本的细胞过程至关重要。Arsb 主要用于多糖的消化，是一种添加性下调的unigene, RT-qPCR结果支持这种差异表达。ARSB在糖胺聚糖(GAG)的降解中发挥核心作用，该基因的调控改变可导致多糖的溶酶体排泄。最后，参与氧化磷酸化链的几个差异表达的转录本，如细胞色素氧化酶亚基I和细胞色素氧化酶亚基II，也下调表达。
结论
总的来说，在转录组水平上收集的信息显示，产生低生存能力无节的宽水蚤雌虫表现出对最终繁殖成功至关重要的代谢过程蛋白编码的下调或上调。在分子水平上，参与ATP合成、细胞分化和信号转导的关键基因可以解释5月23日观察到的母细胞介导的无节细胞低存活率。差异表达的序列也可以表明宽水蚤雌虫调控的抵消负性生殖潜能的分子途径。从这个角度来看，已知一些差异表达的基因编码相互连接的蛋白，参与细胞生化模式，最终调节细胞凋亡、细胞周期、卵黄前体细胞(YPP)、基因表达和自噬。这些过程可以部分解开协调的分子途径，导致改变的宽水蚤活力。有趣的是，参与解毒的关键基因，如醛脱氢酶、超氧化物歧化酶或谷胱甘肽合酶，在宽水蚤雌虫中没有差异表达。
虽然作者不能排除本研究未考虑的生物和非生物因素可能影响桡足类动物的分子反应，但作者的数据表明，温度、氧气、pH和盐度起到了边缘作用，因为这些因素在两个采样日期中保持不变。此外，宽水蚤的反应似乎并不是由食物缺乏介导的，因为尽管5月30日的植物浮游生物浓度高于5月23日，但粪便颗粒生产的差异并不显著。有趣的是，在5月23日，羟脂素的浓度和羟脂素的细胞产量都有所提高。A5 Obp的下调可能表明5月23日采集的雌虫对有害物质的检测受损、氧脂素摄取量增加和无节虫存活率降低。的确，本研究的预测是吸引人的，但需要更大的数据集来支持，以探索更广泛的时间变化，在繁殖成功和自然宽水蚤的分子响应。作者的分析可以为在分子水平上解释桡足类动物在实验室实验和自然环境中对生物和非生物变量的生殖反应提供指导。
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