科研│CELL：单细胞分辨率下人类肠道发育的时空分析
编译：微科盟 骆芷寒，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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本研究结合单细胞RNA测序与空间转录组学来表述随时间变化的肠道形态。首先鉴定了101个细胞群，包括上皮和间质细胞群以及与关键形态发生有关的过程的细胞群。文中描述了隐窝-绒毛轴形成的原理以及神经，血管，间质细胞形态发生和发育中肠道的免疫群体。此外，本研究确定了生长中的成纤维细胞和肌成纤维细胞亚型的差异，并确定了包括血管功能nichi细胞在内的不同功能。本研究还发现淋巴块和肠道相关淋巴组织（GALT）的起源，并描述了其特定的免疫程序。研究人员利用积累的资源阐述一种正确的形态变化分析，该分析指出了细胞分化的连续波并明确了细胞及与罕见的发育性肠道疾病有关的位置。最后，研究人员在线发布分析胎儿肠道发育（STAR-FINDer）的时空分析数据，以便于下一步研究。
论文ID
原名：Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution
译名：单细胞分辨率下人类肠道发育的时空分析
期刊：Cell
IF：38.637
发表时间：2021年2月
通讯作者：Hashem Koohy，Alison Simmons
通讯作者单位：牛津大学 MRC Weatherall分子医学研究所(WIMM)
DOI号：10.1016/j.cell.2020.12.016
实验设计
结果
1 在发育时间和空间上对101种肠细胞类型进行分类
首先从17个单独胚胎收集的77个肠道样本中生成了scRNA-seq图谱，这些样本代表了不同的发育时间点和组织位置（图1A和1B）。该数据集范围为8到22 PCW，此范围涵盖了从隐窝形成之前到成人状绒毛/隐窝形态的发展的时间点。（图S1）。并且本研究使用寡核苷酸标记的抗体开发了具有自定义多重化策略的完整组织样品消化方案，该研究产生了76,592个细胞（图1）。
聚类分析将这些细菌分为9个肠区室，并以转录信号进行注释，上皮，成纤维细胞，内皮（EC），周细胞，神经（ENS），肌层，间皮，肌成纤维细胞和免疫（图1C和1D）具有明显的位置和发展时程差异（图1E和1F）。根据关键标记基因进行的精细聚类注释进一步确定了区室中的101个亚群，使用基于分区的图抽象法描绘了它们之间的关系（图1G; 表S1 ; STAR方法）。
随后进行了转录因子（TF）调控网络的映射分析，以突出显示每种细胞类型的关键调控网络。该结果确定了464个TF模块，概述了已知的发育调节因子以及306个开发时间过程和44个位置变化的调控网络。同时绘制了所有101种细胞类型之间的串扰图，确定了成对细胞群之间的推定受体-配体（RL）相互作用。
2 单细胞的空间位置
为了绘制scRNA-seq数据的空间分布图，作者对整个肠道发育的组织进行了空间转录组学分析（ST）（图1）。对ST斑点的转录特征进行分析后，发现每张玻片中有5-13个斑点簇，这些簇被映射到不同的位置（图2A）。使用先前得出的scRNA-seq图谱为基础进行了因子分析来确定每个斑点的可能单细胞组成，从而在空间上定位所有scRNA-seq簇。同时，本研究使用了成年人上皮，基质和免疫的scRNA-seq数据。此外，单个基因的表达与形态一致，RET在肌间神经丛和粘膜下淋巴滤泡PTPRC (CD45)中均有特异性表达。
3 人肠上皮发育
子宫内上皮隐窝的形成建立了粘膜屏障维持的回路。本实验中的获取了17622个上皮细胞的数据，在上皮细胞中的吸收细胞（肠上皮细胞和BEST4 / OTOP2细胞），分泌性细胞（EEC，杯状细胞和分泌性祖细胞），未分化的以及干细胞上具有容易区分的基因标记（图3）。吸收细胞基因表达反映出类似于成人上皮的成熟光谱。此外观察到近端（小肠）和远端（结肠）样品之间的位置差异很大，这些样品由高度特异性的基因表达（例如CCL25和APOE）划定（图3A和3B），并由轨迹分析和多个TF模块确认（图S3A）。该结果显示，在隐窝形成之前位置特异性转录程序在发育中已被建立。
图3.子宫上皮成熟和隐窝发育图谱。（A）UMAP图根据位置（ii）和发育时程（iii）可视化上皮区室种群（i）和上皮细胞分布（B）上皮簇标记物的点图，颜色指示簇内平均表达，点大小指示簇内基因表达细胞的百分比（C）选定的丰度在发育时间过程中的变化以条形图显示。根据Wilcox等级检验，p<0.05 ∗；p<0.01 ∗∗ ; p<0.001 ∗∗∗ 。误差棒代表平均值的标准误差（SEM）（D）小提琴图，显示了在远端和近端干细胞中所选时程变化基因的表达（E）UMAP覆盖可视化上皮细胞中GATA4的表达（i）和通过免疫组织化学（IHC）染色的GATA4染色的10、17和22PCW胚胎组织的SI切片的代表性图像（n = 3， 10x / 20x放大比例尺= 360/180μm）（ii）（F）IHC对转铁蛋白（TF）染色的10个和17个PCW胚胎组织的SI切片的代表性图像（n = 3，20x / 100x放大比例尺= 180 /40μm）（G）通过单分子原位杂交（sm-ISH）对10、12和17个PCW胚胎组织和成年结肠组织进行LGR5表达染色的结肠切片的代表性图像（n = 3， 20x / 100x放大比例尺= 180 /40μm）（H）在上皮细胞的发育时间过程中ASCL2 TF模块AUC评分的UMAP叠加。（I）用IHC对BEST4进行BEST4染色的10个和15个PCW胚胎组织的结肠切片的代表性图像（n = 3， 20x / 40x放大比例尺= 180 /90μm）
4 ISC的发展起源
作者观察近端和远端的ISCs随时间逐渐增加，这与ISC转录程序的早期位置差异形成对比，例如远端LEFTY1和近端FOXD1及其下游调控网络基因（图3C，3D）。在早期发育（<12 PCW）中，作者发现了近端上皮干样祖细胞群，该细胞群发展为早期肠上皮细胞。这些细胞表现出许多原始功能，包括高表达VTN在中胚层分化。这些细胞在SI中唯一表达的TF GATA4（图3Ei）是一种小鼠早期内胚层调节剂，该表达在12 PCW后大部分丢失（图3Eii）。 TF在这些细胞中高度表达（图3B和3F）证实了铁代谢在绒毛形成中的重要性。
LGR5是一个特征明确的ISC基因，在早期妊娠（<12 PCW）近端/远端ISC和茎状祖细胞中能够以低水平弥漫性检测到。原位杂交（ISH）证实了10 PCW处的弥漫性LGR5表达，该表达之后定位于隐窝碱基（图3G）。即使在隐窝形态建立之后（例如19 PCW之后），ISC仍分别构成远端/近端样本中捕获的上皮细胞的18％–22％（图3C），高于成年结肠的scRNA-seq研究中捕获的3％–4％。与此数据相符，作者发现ASCL2 TF随着时间的增加而显著增加（图3H）。
5 肠道血管生成的建立
在EC中能够清楚看到转录信号与结构特征相对应。本研究将EC分为静脉，动脉和淋巴管类型，并根据血管大小进行了进一步区分（图4）。在整个发育过程中观察到从小血管到大血管的过渡，反映了肠道血管生成过程。并确定了驱动这种变化的TF网络，例如动静脉分化器HEY1和SOX13。
图4.间充质和内皮区室细胞的协调发育。（A）内皮区隔亚群的UMAP可视化（B）点热图，显示选定的周细胞亚簇标记。通过在簇内具有至少最小（> 0）检测标记的细胞百分比来缩放点，并通过平均簇表达进行着色（C）（i）发育过程中成熟的成肌纤维细胞群体的丰度变化以柱状图显示。根据Wilcox等级检验，p<0.05 ∗；p<0.01 ∗∗ ; p<0.001 ∗∗∗ ; ns =无显著差异。误差棒代表平均值的标准误差（SEM）。（ii）基于分区的抽象图，其显示了成肌纤维细胞标志物RSPO2的表达（D）成肌纤维细胞的细胞类型预测和S3在19 PCW时过渡的ST斑点覆盖。所有H＆E图像和相应的斑点覆盖图都显示了来自ST组织H＆E图像部分A4的选定区域 （E）ENS和神经胶质祖细胞的丰度在发育时间过程中的变化以条形图显示。根据Wilcox等级检验，p<0.05 ∗；p<0.01 ∗∗ ; p<0.001 ∗∗∗ ; ns =无显著差异。误差棒代表平均值的标准误差（SEM）（F）点热图，显示选定的肌肉细胞亚群标记。通过在簇内具有至少最小（> 0）检测标记的细胞百分比来缩放点，并通过平均簇表达进行着色（G）（i）UMAP覆盖可视化成纤维细胞亚群。UMAP覆盖图显示成纤维细胞在发育时间（ii）和位置（iii）上的分布 （H）S12祖细胞和静脉（CP）细胞在12个PCW ST玻片中的共定位（i）; S3标记C7与成年ST玻片中大血管的共定位（ii）和S3 EBF +（iii）和S3 HAND1 +（iv）细胞在成年玻片中血管周围的定位。H＆E图像点叠加图显示了ST组织H＆E图像部分A8（i）和A1（ii-iv）中的选定区域。
6 引导肠道发育的形态发生梯度的无偏映射
理解肠道发育的一个基本问题是解释局部形态发生素梯度及其拮抗剂如何影响肠道绒毛的形态发生。因此本研究创建了涉及8条途径的基因的形态发生图，以阐明这些分子在空间和时间上的作用。共表达分析结果确定了11种细胞类型特异性和13种在空间上共定位的形态发生模块，随后在所有ST玻片中对模块活性进行了评分（图5）。这些部分通常与ST中的组织深度对齐。空间3由来自EC，成纤维细胞和周细胞起源的形态生成素组成（包括LRP1），并且位于组织深处（图5）。上皮特异性模块表达来自Hedgehog通路（IHH）的基因，位于管腔附近（图5Bii）。另一个含有肌成纤维细胞成分的部分具有形态发生原WNT2B和受体RSPO2，该部分在12 PCW时弥漫性出现，并在之后逐渐定位。这与发现成熟的成肌纤维细胞在上皮成分后出现的结果相一致，表明ISC-成肌纤维细胞信号传导回路在隐窝形成后才建立。WNT2B由间皮表达，提供了成肌纤维细胞分化之前的唯一配体来源。与此类似的RSPO3可以经由信号到ISC的LGR5，其在间皮/肌层模块中含量很高，并且主要在12 PCW之前见到，然后随着时间增长和组织深度的增加而消失（图5C）。这表明随着肠的发育，原本可能因层间距离的增加而被打破的形态梯度，可以通过的细胞类型的表达而恢复。
7 S2成纤维细胞具有位置特异性并能控制上皮形成
隐周S2成纤维细胞或末梢细胞通过表达来自转化生长因子β（TGF-β）超家族和WNT途径的配体向上皮提供支持。本研究从表达TGF-β（BMP2，BMP4和BMP5）和非经典WNT途径（WNT5A和WNT5B）的关键形态发生子中鉴定了三个不同的S2簇。这些S2特异性基因形成了一个主要的粘膜下成纤维细胞形态发生模块（scRNA-seq模块2）的一部分，该模块包含DLL1，BMP5和NRG1（图5D）。这突出显示了S2细胞及其提供的富含形态发生素的nichi在上皮细胞形成中同样重要。
与其他成纤维细胞种群不同，TI和结肠S2细胞具有885个差异表达的基因（<5％FDR），其中包括POSTN或TI-prominent PDGFRA的结肠特异性表达（图S7D）。在10 PCW之前检测到许多特定于位置的差异，这表示在隐窝/绒毛形式之前就具有很强的位置同一性，例如POSTN和BMP3在它们各自的S2亚型中很早就被发现（图5E）。S2形态生成素谱中的这种关键的位置差异提示了一种机制，通过该机制可以发展出极大不同的上皮形态。
最后确认S2标记F3在隐窝形成之前就已经存在，并且形成的小丘随着绒毛的形成而逐渐增加（图5F）。因此，在人的肠道中，S2型成纤维细胞不仅是上皮隐窝位维持所必需的，而且在其形成中也起着积极的作用。
8 淋巴组织形成过程中的免疫细胞异质性
本研究在整个发育过程中搜集了2,199个免疫细胞（图6A和6B）的相关数据，这些细胞来自6个谱系（巨噬细胞，单核细胞，树突状细胞，嗜酸性粒细胞，适应性和先天性淋巴样细胞）。免疫细胞在SI（平均占捕获的所有细胞的3％–8％）中比结肠（平均在1％–2.5％）中更为普遍，并且在孕早期之前尤其罕见。在10 PCW之前观察到了髓样细胞的富集（图S8A），而当PCW为12时，进入了大量的早期CD4+和CD8+T细胞，自然杀手（NK），1型先天淋巴样细胞（ILC）和3型ILC（图6C）。后者在胎儿肠道中的发生率要比成人高得多，占某些晚期样本中捕获的所有免疫细胞的30％。
图6.肠道早期免疫定植和免疫基质相互作用。（A）免疫区室细胞簇的UMAP可视化（B）点图显示了关键免疫区簇标记的表达（C）条形图显示所选免疫区室簇丰度随时间的变化。根据Wilcox等级检验，p<0.05 ∗；p<0.01 ∗∗ ; p<0.001 ∗∗∗ ; ns =无显著差异。误差棒代表平均值的标准误差（SEM）。（D）（i）小提琴图显示了来自结肠和TI细胞的淋巴相关神经胶质（LA Glial）细胞和其他神经细胞中GFRA3的表达。（ii）柱状图显示了结肠和TI神经隔室中LA胶质细胞丰度的时程变化。根据Wilcox等级检验，p<0.05 ∗；p<0.01 ∗∗ ; p<0.001 ∗∗∗ ; ns =无显著差异。误差棒代表平均值的标准误差（SEM）。（E）小提琴图，显示了在发育时间过程中S4成纤维细胞中CCL19（i），CCL21（ii）和CXCL13（iii）的表达。（F）成人组织上覆盖粘膜下淋巴样聚集物的斑点中的ST细胞类型预测结果显示了A1（i）底部和玻片A2中心的成年基质细胞4，T细胞，B细胞和浆细胞的分数（ii）。H＆E图像和点叠加层显示了从ST部分A1（i）和A2（ii）中选择的区域（G）CC成人CC中CCR7和CCL19的表达。H＆E图像和所示的所有斑点覆盖图都绘制在ST H＆E部分A1的选定区域上。
9 S4成纤维细胞是淋巴样结构形成和维持的基础
派尔集合淋巴结（PP）形成的其他关键介体包括通过CCL19，CCL21和CXCL13促进LTi组织归巢的基质组织细胞。本研究发现它们专门定位于两个S4成纤维细胞簇，并且表达随着发育而增加（图6B和6E）。在S4簇中绘制RL相互作用的图谱突出显示了与各种免疫细胞的串扰，包括通过VCAM1 - ITGB7。这进一步支持了S4在淋巴组织形成中的作用以及这些粘附分子是GALT形成所必需的。此外，结果显示LTi细胞和S4细胞通过IL7和CCL19 / 21与受体IL7R / CCR7相互作用。
为了在空间上确认这些相互作用研究了成人ST玻片，其中粘膜下淋巴滤泡被视为独特的结构。S4和免疫细胞（例如CD3和CD19）的关键标记基因在这些卵泡中和周围表达，因子分析证实了各种成人免疫（B细胞，T细胞和髓样细胞）和此处定位的S4细胞类型（图6F）。此外发现ST中与RL配对的显著共定位，包括CCR7 / CC19（图6G）。该结果表明S4细胞是成年结肠中免疫滤泡相邻的成纤维细胞，该细胞在胎儿GALT发育过程中以时间依赖性方式出现。
两个S4簇在很大程度上都是SI特异性的，支持子宫内PP的发育，但不支持结肠GALT。通过比较这两个种群的转录谱发现S4 CXCL13 +亚型表现出许多隐周S2成纤维细胞的关键特征（POSTN，F3，PDGFRA和BMP5），并且是RANKL / TNFSF11的唯一肠道来源，如果缺陷会导致PP形成受损。上述结果表明PPs中相同的隐周成纤维细胞起着上皮隐窝位支持细胞，淋巴组织形成的协调者和间质免疫串扰的介质的作用。
10 先天性肠道疾病的细胞基础的图谱
先天性肠道疾病的发病机制仍然不明确，因为缺乏遗传缺陷的基础，而且子宫内早期会发生一些异常。肠道腹侧突出，伸长，旋转和重新定位都发生在妊娠的前三个月，并且偏差可能导致诸如卵突囊肿的缺陷。为了揭示可能导致先天性肠道疾病的时间关键性转录缺陷，本研究将数据与人表型本体论（HPO）的围生期肠道疾病的经典清单相关联，并注明了遗传表型。通过将749个已知的疾病基因与先前的scRNA-seq数据整合在一起，作者将先天性疾病与表型相关联。关联结果表明这些表型可能会通过高度细胞类型特异性缺陷表现（图7A和7B）并导致肠道，腹，会阴，神经节，炎性或肿瘤病理疾病（图7A）。
这些数据包括远端肠上皮细胞中的SPINT2和DGAT1，两者缺陷可能导致严重的先天性腹泻。SOX10和RET与Hirschsprung病（小肠神经节）有关，两者在ENS中表达（图7Cii）。考虑到这些细胞在淋巴滤泡形成中起作用，综合上述的数据，可以判断出这种疾病与Hirschsprung病（肠结肠炎）的并发症有潜在的联系，这种疾病是由去除神经节肠球后复杂的神经-免疫相互作用引起的。
讨论
近期的scRNA-seq研究结果已经确定了成年肠上皮，间充质和免疫细胞内细胞类型和状态的多样性。但是在大量情况下，它们的起源，作用和发展时机仍不清楚。因此在目前进行的研究工作中开始使用无偏差的高通量方法研究这一问题，该方法已被扩展应用在早期的小规模研究中。
本研究的主要优势在于可以捕获完整厚度的肠组织，该方法能够绘制所有肠腔的图。本研究的数据还涵盖了几个关键的发育事件：上皮隐窝-绒毛形成，间质的分化，肌肉层的建立，血管系统的扩张，免疫定植和GALT的出现。对此，作者提供了对不同种群协调出现的见解，定义了调节其发育的TF网络，并绘制了与相邻细胞的串扰性质。
本研究确定了区分SI和结肠上皮的程序，发现了该程序在隐窝-绒毛形成之前已做出了导致成熟小肠和大肠独特细胞解剖的位置细胞命运的决定。同时，作者观察到祖细胞样细胞在早期发育中占主导地位，并形成了LGR5 +12 PCW的hillocks。与大多数其他上皮细胞形成鲜明对比的是，BEST4 / OTOP2细胞的转录特征在隐窝形成之前就已经建立，并且独立于在随后观察到的隐窝-绒毛轴动力学。尽管在22 PCW时观察到的上皮细胞类型与成年组织相似，但未成熟细胞的比例更高。这种未成熟上皮的患病率可能导致疾病，例如早产儿坏死性小肠结肠炎。
最近的研究表明，肠道成纤维细胞在转录和功能特性上各不相同。本研究结果显示，位于小肠上皮附近的telocytes / S2成纤维细胞是上皮隐窝支持所必需的形态发生因子的关键来源，并在隐窝形成定位为hillocks之前已出现。同样，本研究将 S3型成纤维细胞的功能确定为脉管系统小生境细胞，因为ST将这些细胞聚集在大血管周围。这些细胞表达补体成分，表明参与了血管发育过程中的局部组织重塑。
细胞亚型的时间动态揭示了形态发生，这在形成GALT的过程中很明显。该过程起始于12 PCW处LTi和S4种群的协调出现，随后B和T细胞数量增加（图6C和6E）。S4成纤维细胞首先被报道为溃疡性结肠炎（UC）相关细胞，该细胞具有滤泡性网状细胞的特征。在本研究中使用ST明确地将它们定位于成年结肠中的粘膜下淋巴样聚集体，并进一步定义了两个胎儿亚群，这些亚群可能指导子宫内GALT和PP的形成。
此外，本研究利用这些数据为新生儿疾病提供见解。通过跟踪与这些遗传缺陷相关的基因到高度特定的时间点和细胞类型后获得了有关在子宫内研究具有挑战性的疾病的信息。最后，本研究通过交互资源，胎儿肠道发育的时空分析资源（STAR-FINDer）展示了这些高维度数据的各个方面。
1 科研│ CELL STEM CELL: 在单细胞分辨率下探究肠道生态微环境发育图谱
不来关注一波嘛
END