编译：yuan，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
抗生素可以改变微生物群的组成，增加感染的易感性。然而，抗生素对肠道共生物的普遍影响以及其中环境因素的贡献仍不清楚。为了解决这一问题，我们通过分离饮食、治疗史和居住环境等变量，以高时间-分类学分辨率跟踪抗生素处理过程中的微生物群动态。
人类微生物群具有卓越的弹性并且可在抗生素处理过程中得到恢复，期间耐药Bacteroides暂时占优势地位并且分类不对称多样性减少。在某些情况下，体外敏感性并不能预测体内反应，这强调了宿主和肠道环境的重要性。纤维缺乏饮食加剧了微生物群的崩溃和复苏延迟。环丙沙星处理后通过交叉笼养完成物种替代建立了对第二次抗生素处理的恢复力。单一笼养急剧破坏了复苏，突出了环境微生物储蓄的重要性。我们的发现强调了决定性微生物群对干扰的适应和在抗生素期间调节饮食、卫生和微生物群组成的转化潜力。
原名：Recovery of the Gut Microbiota after Antibiotics Depends on Host Diet, Community Context, and Environmental Reservoirs
译名：抗生素后肠道微生物群的恢复取决于宿主饮食、肠道环境和环境因素
期刊：Cell Host & Microbe
IF：15.753
发表时间：2019.11
通讯作者：Kerwyn Casey Huang
实验采用6-12周大的Swiss-Webster小鼠。拟人化小鼠是采用从健康的匿名捐赠者处获得的人类粪便样本进行灌胃，单克隆定植小鼠是用整夜培养的拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)灌胃并让其适应2周，传统小鼠则在同笼正常喂养。
抗生素处理是将抗生素溶解于200 mL水中，给小鼠进行为期5天灌胃。
在涉及饮食变化的实验中，首先给小鼠喂食富含MACs的标准饮食，然后是低MAC饮食，其中碳水化合物来源是蔗糖(31% w/w)、玉米淀粉(31% w/w)和纤维素(5% w/w)。
按照规定时间对小鼠粪便取样进行16S rRNA测序分析，并在特定时间处死小鼠，保留回肠、近端结肠和远端结肠进行切片染色并成像分析。
1 链霉素的巨大短暂干扰后微生物负荷迅速恢复
我们首先想确定在抗生素处理期间肠道微生物群被破坏的程度，以及总体丰度和组成的恢复时间尺度。我们为15只无菌小鼠移植了来自同一供体的人类粪便(“拟人化”)并置于3个笼子中，每天给予20mg的链霉素，持续5天(days0-4)。在第一次灌胃前、第一次灌胃12小时后(day0.5)和接下来的14天每天收集粪便进行16S rRNA测序。在day0、1、5、8和14各处死3只老鼠用于其他分析(Fig.1A)。我们测量了每个粪便样本中每毫升粪便中可培养菌落形成单位(CFUs)，观察到在day0.5时从1010下降到105-106(Fig.1B)。尽管如此，厌氧细菌负荷在day1恢复到了>1010CFU/mL并在此后day2-4继续给药期间仍保持在1010-1011。这些快速的变化说明，即使是每天的采样也可能会错过由抗生素引起的密度迅速下降现象。需氧菌的密度明显低于厌氧菌(因此对总负荷的贡献极小)并且直到day6才恢复(Fig.1B)，表明尽管细菌负荷恢复迅速，但处理仍在不断地重构微生物组成。尽管存在滞后和动力学变化，链霉素仍可引起普遍的组成恢复轨迹。使用16S测序，我们识别并利用DADA2对照扩增子序列变异(ASVs)，它使用误差校正以避免多样性被高估；这些ASVs代表预测的物种。所有小鼠的菌群组成的崩溃和恢复是相似的。处理前，小鼠的Bacteroidetes和Firmicutes的丰度相似；这两个门占了丰度的>95%(Fig.1C)。day1，Bacteroidetes细菌数量下降到<10%(Fig.1D)，而Firmicutes增加(Fig.1C)。day2，Bacteroidetes细菌恢复到使用抗生素前的相对丰度(Fig.1D)，总培养负荷也是如此(Fig.1B)。处理期间，Beta-proteobacteria从~2%增长到~5%并保持在此水平(Fig.1C)，表明它们正好填补了处理造成的间隙。主坐标分析(PCoA)通过测量组成的相似性表明这些动力学变化是明显的：所有的老鼠都在day1沿着坐标1达到了一个的最大干扰的公共点(Fig.1E)。因此，尽管开始时细菌负荷大量减少(Fig.1B)，但达到最大干扰的路径是确定的。在day1之后，微生物群沿着不同的路径重新恢复平衡到处理前的组成结构，而不是穿过最大干扰点(Fig.1E)。除了这种滞后现象外，恢复动力学也不同。一些小鼠在day5已经恢复到day0的状态，而另一些小鼠恢复得慢一些(Fig.1E)，这可能是由于它们依赖于从其他小鼠重新播种的结果。尽管如此，所有小鼠在坐标1和2的空间中都遵循相似的轨迹(Fig.1E)，这表明，尽管动力学差异存在，中间恢复状态仍是相似的。
2 环丙沙星处理产生的微生物群动态变化与链霉素相似
为了确定细菌负荷和组成的快速恢复是否是链霉素所特有的，我们对14只“拟人化”小鼠(共关在3个笼子里中)进行了环丙沙星处理，一种广谱DNA旋转酶抑制剂。每天两次，每次5mg，持续5天(Fig.S1A)。可培养细菌的厌氧成分从最初到day1下降了100-1000倍，但在day3停止给药前恢复(Fig.1F)，与链霉素处理的小鼠一样(Fig.1B)。环丙沙星的门级效应，尤其是PCoA的作用轨迹，与链霉素相似(Fig.1C和1G)，尽管动力学存在差异(Fig.1E和1I)。这种相似性中至少有一部分是由最初的Firmicutes代替Bacteroidetes引起的(Fig.1C、1G和Fig.S1B)。Bacteroidetes的相对丰度在day1下降到10%-25%，但在day3恢复并在此后保持稳定(Fig.1G)。这种恢复主要与单个拟杆菌Bacteroidesvulgates(Bv)匹配的ASV有关，在使用抗生素之前此ASV为4%，但在处理期间所有小鼠的ASV升高到50%(Fig.1H)。处理结束后，Bv被S24-7家族成员所取代(Fig.1H)，表明这两个家族在争夺一个共同的生态位点。我们用Bacteroides选择基从Bv优势时期的小鼠样本中分离了12个菌落；16S Sanger测序结果显示所有分离株均为Bv。虽然在链霉素作用下Betaproteobacteria大量增加，但是环丙沙星处理停止后Verrucomicrobiaceae繁荣生长，再次表明了缝隙的开放。因此，环丙沙星和链霉素影响成分的方式惊人地相似，尽管造成的分子效应存在巨大差异，但在恢复过程中存在两者之间的差异。
3 环丙沙星恢复期间的笼养特异性效应表明了环境微生物储蓄的重要性
最大干扰后，一部分环丙沙星处理小鼠继续遵循链霉素处理小鼠的恢复轨迹，而其余小鼠仍处于干扰状态(Fig.1I)。有趣的是，这些子集完全由笼养决定的(Fig.1J和1K)，这表明细菌重新播种在恢复中起着重要作用。然而，在接受环丙沙星处理的小鼠中，一个明显的显著特征是S24-7家族的动态变化；S24-7是Bacteroidetes成员，在处理前大量存在(~35%)并且在恒温动物中存在非常普遍。在一个PCoA空间上显示完全恢复的笼中(Fig.1J)，S24-7在处理后期消失，但在去除环丙沙星后直接重新出现，并重新建立到处理前水平(Fig.1K)。相反，在另一个笼子里，S24-7直到day10才被检测到，并且在day14只恢复到~5%(Fig.1K)。在链霉素处理小鼠中，所有笼子中的S24-7均恢复了，甚至在停止使用抗生素之前(Fig.S1E)。对异质性的一种可能的解释是，每只小鼠保留S24-7或从笼池中重新克隆S24-7的可能性较低，但随后笼中其余小鼠恢复了S24-7。这些数据表明，笼内宿主微生物的多样性是抗生素处理后恢复的重要驱动力。
Fig.1 不同抗生素期处理期间人体微生物群的快速恢复和常见的崩溃和恢复的轨迹，但终点具有笼养特异性
(A)无菌小鼠的拟人化、抗生素处理和取样示意图。
(B和F)(B)20mg/day链霉素(n=15)和(F)3mg/day环丙沙星(n=14)处理5天的小鼠菌群可培养的厌氧和好氧粪便密度。处理期间的细菌负荷恢复(彩色区域)。误差带：标准误。
(C和G)(C)经链霉菌素处理和(G)经环丙沙星处理的小鼠的粪便中科水平的组成相似。
(D和H)(D)经链霉菌素处理和(H)经环丙沙星处理的拟人化小鼠的Bacteroides、S24-7和Bacteroidetes的相对丰度。
(E和I)(E)链霉素或(I)环丙沙星处理的拟人化小鼠群落组成的PCoA呈现保守的变化轨迹。分析使用加权UniFrac距离。
(J)在使用环丙沙星的拟人化小鼠的两个笼子的PCoA发现了笼子特异性差异。
(K)来自两个笼子(H)的科级组成显示了S24-7恢复的随机性。
4 抗生素导致α多样性的持续丧失是受Bacteroidetes细菌数量减少的影响
尽管与处理中使用的抗生素无关，Bacteroidetes和Firmicutes的可培养密度和门级相对丰度回到了抗生素使用前的状态(Fig.1B、1C、1F和1G)，我们感兴趣的是S24-7缺失对一些小鼠的长期影响(Fig.1K和S1D)和Bacteroidetes spp.的寡优势(Fig.1H)。为了确定细菌灭绝的影响，我们量化了α多样性(观察物种的数量)，这是一种衡量群落恢复能力的方法。我们发现链霉素和环丙沙星处理期间小鼠细菌α多样性均下降(Fig.2A和2B)，但环丙沙星处理小鼠的细菌负荷下降虽然较小，但其α多样性下降较大(Fig.1B和1F)。在去除两种抗生素后α多样性缓慢增加，并重新在低于处理前水平上建立平衡(Fig.2A和2B)。这种α多样性的持续减少主要是受Bacteroidetes细菌的影响，链霉素和环丙沙星处理小鼠的多样性分别永久性地减少了36%和70%(Fig.2C和2D)。相反，Firmicutes的多样性只受到轻微的影响(Fig.2C和2D)。在经链霉菌素处理的小鼠中，Bacteroidetes多样性的减少主要是由Bacteroidaceae(包括Bacteroides)引起的(Fig.2E)；S24-7多样性恢复到接近处理前的水平(Fig.2E)。相反，在环丙沙星处理小鼠中，Bacteroidaceae和S24-7的多样性均大幅下降(Fig.2E和2F)，且在去除环丙沙星后仍保持较低水平；S24-7多样性从实验前的~17ASV降低至1(Fig.1F)，表明某些物种已完全灭绝。总之，我们的结果表明，这两个优势门对两种不同的抗生素表现出不对称的脆弱性，而Bacteroidetes的损失和恢复最可能受到笼内同伴的影响。
Fig.2 抗生素的使用通过减少Bacteroidetes的多样性来改变微生物群的状态
(A和B)链霉素和环丙沙星处理(有颜色的区域)后，微生物群稳定在较低的α多样性。
(C和D)链霉素和环丙沙星处理对拟杆菌门α多样性的影响远大于厚壁菌门。
(E和F) S24-7和Bacteroidaceae的α多样性均受(E)链霉素和(F)环丙沙星处理影响，但S24-7尤其受环丙沙星影响。
5 环丙沙星处理期间和处理后的抗生素耐药性和属内竞争决定了Bacteroides菌种的相对丰度
Bacteroidaceae中相对丰度的短暂下降和细菌种类的灭绝(Fig.1C、1G、2E和2F)表明这些物种在抗生素处理期间经历了选择。为了确定这种行为是否在很大程度上受到耐药性选择的驱动，我们进行了第二次抗生素处理(Fig.3A)。我们使用环丙沙星是因为它比链霉素更能降低α多样性(Fig.2)。厌氧菌成分在第二次处理时受到的影响可忽略不计(Fig.3B)，这与科水平组成变化的缺乏相一致(Fig.3C)。尽管在第二次处理期间没有科水平的变化，但是Bacteroidaceae在两次处理期间下降到一个单一优势ASV(Bv)，然后在环丙沙星去除后恢复到2-5的ASVs(Fig.3D)。为了检验环丙沙星耐药性的出现在多大程度上解释了“拟人化”小鼠对第二次处理的反应，我们从两只小鼠的粪便样本中分离出菌株。我们通过16S测序确定菌株为Bacteroidesspp.，测定其对环丙沙星的最低抑制浓度(MICs)值。抗生素处理前的Bacteroides分离株的MICs在文献报道值范围内(2-16mg/mL)。与day0分离的Bv分离株相比，从抗生素处理期间或处理后样品中分离出的Bv分离株增加了100倍(Fig.3D)。对一只小鼠的Bv分离株的进行全基因组测序显示，day4、12或16分离株，而不是day0分离株，具有gyrA突变，可产生环丙沙星耐药性。day4、12或16分离菌株的基因型与day0分离菌株的基因型有高度差异(Fig.3H)，这表明初始菌群包括多个对环丙沙星敏感程度不同的Bv菌株，而抗生素处理重新构建了它们的相对丰度。这种优势只发生在抗生素处理期间(Fig.3D)。停止处理后，虽然Bacteroidaceae的总相对丰度趋于稳定，但day6的Bv菌株优势迅速转化为多种Bacteroides ASVs(Fig.3D)。因此，其他Bacteroides能够在没有抗生素的情况下重新播种和/或恢复，然后与Bv产生有效竞争。环丙沙星处理期间，常规小鼠和“拟人化”小鼠的恢复轨迹相似，但动力学不同。为确定“拟人化”微生物群的成分反应是否受到了抗生素应用史和/或“拟人化”本质影响，我们在常规老鼠上进行了双次处理实验，尽可能不像接受人类菌群的“拟人化”小鼠一样经历多次抗生素处理史。在任何小鼠抗生素处理期间，细菌负荷(Fig.3E)和Bacteroidetes丰度(Fig.3F)都没有得到恢复。相反，处理结束后1天Bacteroidetes恢复，与粪便中环丙沙星清除的时间标度相匹配(Fig.S3E)，这种恢复几乎完全是由于Bacteroidaceae丰度的增加。与“拟人化”肠道环境在处理过程中表现出的耐药菌株的富集和优势相反(Fig.3D)，所有从处理前后常规小鼠体内分离得到Bacteroides分离株的MICs均为4-8mg/mL(Fig.3G)；两种处理中抗性的缺乏与细菌负荷的降低是一致的(Fig.3E)。全基因组测序表明，day11分离株与day0分离株几乎完全相同(Fig.3H)，没有明显的耐药性突变。与缺乏选择相一致，多个Bacteroidesspp.在抗生素处理后的一段时间内保留了。因此，尽管“拟人化”小鼠和常规小鼠的给药条件相同，但在一个复杂的群落中，对拟杆菌耐受性的选择并不是预先注定的；在第二次处理期间，常规小鼠的细菌负荷和相似的组成动力学大幅下降，表明整个群落缺乏耐药性。与Bacteroides敏感性相伴的是，S24-7反应灵敏但从未恢复到某些“拟人化”小鼠中观察到的高密度(Fig.3C和3F)。综上所述，我们的数据表明，传统的小鼠菌群比“拟人化”的小鼠菌群更敏感。第二次处理的效果与第一次处理非常相似：CFU/mL下降约10-100倍(Fig.3E)，以及Firmicutes和Verrucomicrobiae代替Bacteroidetes(Fig.3F)。直到处理停止3天后才检测到Bacteroidetes(Fig.3F)，所有小鼠的S24-7水平在第二次处理后立即检测不到(Fig.3F)。因此，如果不能从第一次处理中完全恢复，传统的微生物群就会在第二次处理时受到更严重的干扰。
6 Bacteroides对链霉素的体外抗性与其体内反应相反
抗生素耐药性似乎可以解释Bv对环丙沙星的反应；因此，我们想知道链霉素处理1天后Bacteroides的恢复是否也与耐药性有关(Fig.1D)。既往研究表明，厌氧菌在体外对链霉素等氨基糖苷类具有耐药性，因此令人惊讶的是，在链霉素处理的12小时内，Bacteroidetes大量减少(Fig.1C)。我们测量了处理前供体样品中Bacteroides菌株和分离株的体外链霉素MICs。大多数未见不良生长作用，最高检测剂量为512μg/mL，支持了对Bacteroides耐药性的结论。尽管在处理前Bacteroides有17%，但在处理后其总丰度减少了约105倍，与其他群体相似，因为他们是直接培养的。为了测试这种下降是间接地来自于其他物种的死亡(这将影响交叉喂养和营养有效性)还是来自宿主相关的影响，我们用B.thetaiotaomicron单克隆了无菌小鼠，并用链霉素对它们进行了处理。CFUs在第一个24小时内下降到与“拟人化”小鼠相似的程度(Fig.S4A)，这表明宿主在某种程度上逆转了B. thetaiotaomicron对链霉素的自然抗性。这些数据表明，体外药敏测量不一定能预测体内反应。此外，与环丙沙星处理的“拟人化”小鼠相反，我们没有在链霉素处理的小鼠中观察到Bv的优势(或其他Bacteroides spp.优势)(Fig.3I)，这支持了一种假说，即在抗生素处理过程中，耐药株的选择产生了优势菌株。在常规小鼠中，没有观察到优势(Fig.3G)，因为在抗生素处理期间，似乎没有耐药菌株能够战胜敏感菌株。在链霉素的情况下，缺乏选择很可能是由于Bacteroides几乎普遍的耐药性。
Fig.3 在重复环丙沙星处理的情况下，常规小鼠和拟人化小鼠的微生物群表现出明显的特征
(A)两疗程环丙沙星处理方案。
(B和E)环丙沙星处理的(B)拟人化和(E)常规小鼠的可培养的厌氧和好氧粪便密度显示，常规小鼠对两种处理的反应相似，但拟人化小鼠的第二次反应更强烈。误差带：标准误。
(C和F)(C)拟人化和(F)常规小鼠的粪便中科水平组成进一步证明了两种小鼠对第二次处理的稳健性。
(D、G和I)由于对抗生素的耐药性不同，耐药菌株在抗生素处理期间占主导地位；其他Bacteroidesspp.在使用抗生素后会扩张。显示的是(D)环丙沙星处理的拟人化小鼠、(G)环丙沙星处理的常规小鼠和(I)链霉素处理的拟人化小鼠中10个最丰富的BacteroidesASVs的相对丰度。B.sp，unknown Bacteroides spp.；Bc，B. caccae；Bs，B. salyersiae；Bf，B.fragilis；Bu，B. uniformis；Bi，B.intestinalis；Bv，B. vulgatus；Ba，B. acidifaciens。在采样天数上标记MICs并根据16SSanger测序结果为ASV着色。处理用阴影部分表示。Day19未收集(D)中小鼠的粪便样本。
(H)比较Bv分离株的基因簇和平均核苷酸序列，发现day0分离株与其他日子的分离株不同，常规小鼠的Bv分离株也有聚集。
7 抗生素处理增加了管腔粘液
考虑到耐环丙沙星的Bacteroides优势只出现在处理期间，之后敏感菌株扩增，我们想知道涉及宿主环境的因素，如营养有效性，是否会影响分类学动态变化。因为许多Bacteroidesspp.是已知的黏液利用菌，我们假设他们的恢复可能是由于抗生素处理期间粘液可用性的增加。我们分别在打day0、1、5、8、14收集和固定处死小鼠的组织，并进行DNA和粘液染色和成像(Fig.4A和4B)。我们利用BacSpace软件以量化黏液层的厚度。对于这两种抗生素，我们发现紧密粘液层的厚度随着时间的推移是相对恒定的(Fig.4C)。但处理后的Muc2信号明显向腔内扩张(Fig.4C)，这与无菌小鼠粘液增加相似。在环丙沙星处理的小鼠中，这种松散的粘液增加在整个处理和恢复过程中持续存在，说明这种增加不是由于环丙沙星对粘液的直接影响，因为环丙沙星在day7就清除了(Fig.S3E)；在链霉菌素处理的小鼠中，松散的粘液在day5恢复到基线水平(Fig.4C)。Verrucomicrobiaceae，其中包含降解粘液的Akkermansia muciniphila，在链霉素处理期间或处理后均未见明显的丰度变化(Fig.1C)，但在环丙沙星处理后繁荣(Fig.1G)。此外，全基因组测序揭示：从环丙沙星处理后的粪便中分离出的Bacteroides菌株比处理前分离出的菌株具有更多的粘蛋白和宿主糖降解基因模块(Fig.S4B)，表明进食松散黏液的能力可以促进Bacteroides spp.和其他黏液响应门(Fig.1C和1G)的扩张，抵消Bv的优势地位(Fig.1H和3D)。
Fig.4 抗生素治疗增加肠粘液
(A和B)(A)链霉素和(B)环丙沙星处理前、中、后对拟人化小鼠远端结肠的成像显示松散的管腔粘液持续增加。切片用DAPI染色(上皮细胞DAPI，蓝色；管腔DAPI，红色)和MUC2(绿色)。计算分割碎片出现在黄色。(1)抗生素处理前菌群密集，管腔粘液少，粘液层致密；(2、3)处理后1天管腔DAPI大量减少；(4)管腔DAPI恢复，但管腔内黏液持续疏松。
(C)处理期间，紧密的内层黏液层的厚度大致保持不变，而较松的外腔黏液层在抗生素处理期间增殖并且环丙沙星处理后黏液层仍然保持。误差带：标准差。
8 缺乏多糖的饮食会破坏环丙沙星处理后的恢复
用不含微生物相关碳水化合物(MACs)的饮食喂养小鼠，可使黏液层变薄；缺乏碳水化合物的细菌必须转而利用黏液多糖。MAC缺乏饮食也会选择粘蛋白应用菌，如A.muciniphila，可以与Bacteroides spp.竞争黏液碳水化合物。因此，我们推测在抗生素处理期间，MAC缺乏饮食引起的粘液减少会拮抗松散粘液的增殖(Fig.4C)，因此阻碍了Bacteroidaceae.等黏液利用菌的恢复。我们将Fig.1、Fig.2和Fig.3中微生物群相同的“拟人化”小鼠转变为MAC缺乏饮食2周，然后开始环丙沙星处理(Fig.5A-5D)。正如预测的那样，与标准饮食喂养(STD)小鼠不同，MAC缺陷饮食(MD)喂食小鼠直到停止使用抗生素后Bacteroidaceae才完全恢复(Fig.5D和1G)。这种延迟的恢复伴随着Bacteroidetes内其他科的不完全恢复以及S24-7的完全消除(Fig.5D)。此外，从开始，MD小鼠的α多样性比STD老鼠略低(Fig.5C，p=0.02)并在处理后下降更多(MD小鼠6倍：STD小鼠4倍；Fig.5C)，表明环丙沙星与饮食变化有相加的作用。在MD小鼠中，厌氧细菌负荷(总细菌负荷)(Fig.5B)表现出与STD小鼠类似的动力学(Fig.1F)，虽然需氧细菌下降更多并且恢复慢于STD老鼠(Fig.5B和1F)，α多样性(Fig.5C)和组成(Fig.5D)的恢复也是如此。为了确定饮食变化的影响是否依赖于微生物群，我们对传统小鼠进行了类似的实验(Fig.5A)。在这些小鼠中，细菌负荷受环丙沙星的影响非常大，厌氧密度降低>10000倍(Fig.5E)，相反在传统STD小鼠中下降只有约10-100倍(Fig.3E)。与“拟人化”小鼠恢复相似(Fig.5B-5D)，MD喂养小鼠的恢复延迟于STD小鼠(Fig.5E-5G)。尽管MD常规小鼠起始α多样性更高，但α多样性的下降比在MD“拟人化”小鼠中更持久(Fig.5F)。总之，这些数据表明，转向MAC缺乏饮食加重了环丙沙星的影响，特别是对更敏感的传统小鼠微生物群。
9 不考虑饮食，“拟人化”小鼠环丙沙星筛选一个共同的核心物种
考虑到环丙沙星处理后由于饮食改变导致的多样性减少，我们想知道与STD小鼠相比，MD小鼠的物种灭绝是否会增加随机性。因此，我们聚焦α多样性最低的“拟人化”小鼠中出现的物种(Fig.5H)。一些物种表现出饮食特异性敏感性：在>50%的STD小鼠中发现的6个ASVs和在> 50%的MD小鼠中发现1个ASV在另一饮食中是不存在(Fig.5H)。尽管如此，仍有14个核心ASVs在至少1个MD小鼠和1个STD小鼠的α多样性最低时期存在：在每只STD小鼠中发现6-11个核心ASVs，在每只MD小鼠中发现8-12个(Fig.5H)。14个ASVs中的4个是在所有STD小鼠中均检测到的，其中5个是在所有MD小鼠中检测到的(Fig.5H)。总的来说，这个核心代表了STD小鼠总丰度的~92%和MD小鼠的~90%(Fig.5H)。因此，环丙沙星可以再最大干扰时期不考虑饮食的情况下选择出特定的菌群，即使是在负荷和多样性比STD小鼠下降更大的MD小鼠中。
Fig5. MAC缺乏的饮食使微生物群对环丙沙星敏感
(A)拟人化或常规STD或MD小鼠处理方案。
(B和E) (B)拟人化和(E)常规MD小鼠的可培养的厌氧和好氧粪便密度显示，好氧部分在拟人化小鼠中敏感，而这两个部分在常规小鼠中均敏感。误差带：标准差。处理期间用彩色区域标记。
(C和F)处理后，(C) MD小鼠的α多样性下降幅度大于(F)STD小鼠。
(D和G) (D)MD小鼠粪便中科水平的组成与(G)STD小鼠有显著差异(Fig.1F、1K和1L)。
(H)STD和MD小鼠α多样性最低点核心微生物群系的热图。共享的ASV集中在左侧，而STD和MD特异性的则ASV则出现在右侧。共享核占总相对丰度的比例为~90%(蓝色，左)。
10 最初的抗生素处理可以调节人体微生物群Bacteroides对第二次处理的反应
为了确定Bacteroides和其他菌群对环丙沙星的反应是否取决于整个微生物群的组成，我们用来自不同供体的样本来拟人化小鼠6周。接受第二供体(H2)的小鼠菌群中Bacteroides的比例比接受第一供体(H1)的高(Fig.6A和6B)。我们用上述环丙沙星处理H2小鼠。与之前一样，第一天的Bacteroidetes相对丰度下降，并且Verrucomicrobiae生长(Fig.6B)。然而，此后的反应与H1小鼠明显不同。day2-5天内Bacteroidetes没有恢复，反而是Lachnospiraceae在day3快速生长达到>70%(Fig.6B)。day4，Barnesiellaceae(S24-7和Bacteroidaceae的姊妹科)开始恢复(Fig.6B)。S24-7直到day6才开始恢复，而Bacteroidaeceae直到day9才检测到(Fig.6B)，正如H1小鼠在MAC缺乏饮食转变后的情况(Fig.5D)，说明H2菌群对环丙沙星处理敏感。在整个抗生素处理过程中，H1小鼠中占主导地位的Bv ASV(Fig.6C)最初在H2小鼠中也以相似的水平出现（H2中~3.5%：H1中1.8%），但是知道day10也没有恢复，day14也仅有~6.5%(Fig.6D)。第二次处理导致Bacteroidaceae的反应与第一次处理中H1小鼠的反应类似：相对丰度迅速下降，但随后(day16)恢复到与H1小鼠第2天相当的水平(Fig.6B)，同时出现Bv ASV的优势(Fig.6D)。值得注意的是，我们也从H2小鼠day11的MIC>512mg/mL样本中分离了B. salyersiae，在第二次处理时下降到几乎检测不到的水平(Fig.6D)，这表明在体外耐药性不一定预示体内的反应，很像在链霉素处理期间最初的Bacteroides减少情况。这些观察表明，在生态景观中有独特的Bacteroidaeceae恢复行为，微生物群可以通过抗生素在它们之间移动。
11 交叉笼养期间的入侵加速了从环丙沙星的恢复
环丙沙星处理过程中负荷和分类学组成的巨大动态变化表明其可能受到环境微生物储蓄的入侵。我们预测了H1和H2小鼠对环丙沙星的微生物特异性反应(Fig.6A和6B)，我们还将H1和H2小鼠亚群在day0、1和5放在一起(此后称为交叉笼养)(Fig.6E)。小鼠接受了上述两次环丙沙星处理。除了最初不存在的Barnesiellaceae的转移和繁荣外，H1小鼠的组成动态相对不受H2小鼠交叉笼养的影响(Fig.6F)。相反，H2小鼠Bacteroidaceae的恢复则通过交叉笼养加速(Fig.6G、6I、S5A、S5B)。day5的交叉笼养导致了几波短暂的繁荣，涉及的科并不是稳定环境中的主要组成部分(Fig.6G)。此外，一个最初并没有在H1小鼠中的S24-7 ASV被入侵达到~15%丰度(Fig.6H)，表明S24-7生存依赖于重新播种。到day10，无论交叉笼养如何，所有H1和H2小鼠的科级组成都是相似的(Fig.6A、6B、6F和6G)。然而，在第二种抗生素处理后，H2小鼠的Bacteroidaceae的减少出现在非交叉笼养小鼠中(Fig.6B和6I)，但在交叉笼养得以避免(Fig.6G、6I、S5A、S5B)。在所有交叉笼养的H2小鼠中，在H1小鼠处理过程中占主导地位的的Bv ASV在第一次处理后开始繁荣增长直接达到20%-30%(Fig.6J)，与H1小鼠的水平和从H1小鼠转移耐药株一致。在第一次处理后，这种在交叉笼养H2小鼠中的ASV动态与H1小鼠相同，并且在第二次处理开始时出现了数量上类似的增长(图6J)；在非交叉饲养的H2小鼠中，这种ASV的相对丰度最初下降(Fig.6J)，这表明肠道环境和抗生素耐药性都可能在Bv的动态和优势中发挥作用。因此，交叉笼养有效地将H2菌群向H1菌群的响应方向转移，说明环境宿主可以将微生物群重新编程，使其更稳健地从抗生素中恢复。
Fig6. 交叉笼养介导的Bacteroides入侵提高了微生物群的恢复能力
(A和B)供体样本1(H1，n=5；A)或2 (H2，n=4；B)定殖小鼠的两次环丙沙星处理期间的粪便科水平组成显示，H2小鼠在第一次处理期间发现了延迟的Bacteroidetes恢复，而在第二次处理期间则没有。
(C和D)在(C)H1和(D)H2小鼠中，10个最丰富的BacteroidesASVs(缩写与Fig.5H和5I相同)的恢复模式不同。在H2小鼠样本中计算了两个分离株的MICs。处理周期用彩色区域表示。
(E)使用不同微生物群的小鼠在环丙沙星处理前、期间的交叉笼养示意图。
(F和G)(F)与H2小鼠在day5混合的H1小鼠(n=3)和(H)与H1小鼠在day5混合的H2小鼠(n=3) 粪便的科水平组成。交叉笼养刺激H1小鼠Barnesiellaceae在第一次处理后生长以及H2小鼠Bacteroides在第二次处理后的恢复。
(H)仅在H1小鼠day0出现的S24-7 ASV的相对丰度，然后在day5交叉笼养的H2小鼠中生长繁殖，这突出了潜在的传播。
(I和J) (I)Bacteroidaceae和(J) Bv ASV在所有H1和H2小鼠中(包括交叉饲养和未混合的小鼠)的相对丰度。在两种处理中，Bv ASV在所有H1小鼠中占主导地位，但在H2小鼠中仅在第二次处理中占主导地位。与未混合的H2小鼠相比，在共养的H2小鼠中增加更快，达到更高的水平。
12 环境微生物储蓄的减少损害了微生物群的恢复并增加了随机性
对笼养同伴的入侵的观察(Fig.6F和6H)表明，其他宿主的微生物是抗生素后恢复的重要资源。因此，我们假设用来模仿西方社会日益普遍的卫生条件的单独饲养老鼠会对恢复产生负面影响。我们比较了链霉素处理对合养和单养小鼠的影响；链霉素的选择是基于初始细菌负荷的大幅下降(Fig.1B和1F)，这可能导致随机灭绝。我们从11只共同饲养的无菌常规小鼠中随机选择了6只小鼠，并将其单独饲养(Fig.7A)。在所有小鼠中，厌氧菌在最初24h间下降了102–105，需氧菌减少103(Fig.7A)。随后合养小鼠出现的快速恢复的情况没有在单养小鼠中出现(Fig.7B)，这表明在存在链霉素的情况下，不存在可大量繁殖的物种。合养常规小鼠的组成动态变化(Fig.7C和7E)与经链霉素处理的合养“拟人化”小鼠相似(Fig.1C)，表明拟人化和常规的微生物对链霉素有相似的反应。与此形成对比的是，单养小鼠所表现出的组成与合养小鼠的有显著的不同(Fig.7C-7E)，并且彼此之间也有显著的不同(Fig.7F)；没有两只单养的老鼠在性质上是相似的。尽管Bacteroidaceae在共养小鼠处理期间得到恢复(Fig.7E和S6A)，但在许多单养小鼠中直到处理后才恢复(Fig.7E和S6A)。S24-7在所有合养的小鼠中恢复(Fig.7E和S6B)，但只在一半单养的小鼠恢复(Fig.7E和S6B)；在某些情况下，单养的老鼠会经历短暂的科级别繁殖，而在合养的老鼠中，科级别繁殖的数量很少或为零。停用链霉素后，6只单养的小鼠中有5只的γ多样性显著低于合养小鼠的(Fig.7G)。我们假设，单养的小鼠恢复速度较慢且变化更大，这是在缺乏特定微生物储蓄的情况下随机灭绝的结果，并预测我们将在单养的处理后小鼠中观察到不同的种群。事实上，在单养的小鼠中发现的独特的ASV的总数(类似于共养小鼠的γ多样性)高于合养小鼠的γ多样性(Fig.7G)。综上所述，这些发现加强了环境微生物库对微生物种群的稳健恢复和定殖抗性的重要性。
Fig7. 共笼饲养后，链霉素治疗后的强劲复苏
(A)笼养实验示意图。
(B)经链球菌霉素处理的常规小鼠(有颜色的区域表示抗生素处理时间)的厌氧和好氧可培养粪便密度显示恢复延迟。
(C和D) (C)合养(n=5)和(D)单养(n=6)小鼠的粪便中纲水平组成在单养小鼠中显示出Bacteroidetes恢复延迟。
(E)合养小鼠的科水平组成显示链霉素对Bacteroidaeceae有较强的恢复作用。
(F)单养的小鼠的科水平的组成显示了恢复模式差异。
(G)单养小鼠重新播种的噪音是明显的，因为尽管每个单养小鼠的α多样性较低，但合养小鼠的γ多样性(独特的ASVs)低于作为一个群体对待的单养小鼠的meta-γ多样性。
我们的研究为了解单个微生物菌株、类群和整个群落的抗生素反应提供了重要的认知。尽管有了预测耐药性结果(表S1)，在链霉菌素处理的小鼠中几乎所有Bacteroides死亡(Fig.1B和1C)表明，体外敏感性不一定能预测哺乳动物宿主的复杂生态系统中的反应。在所有定植条件下(拟人化[Fig.1B和1C]，常规化[Fig.7B-7D]，B. thetaiotaomicron单个定殖[Fig.S4A]链霉素处理过程中的Bacteroidesspp.死亡表明药物可能干扰宿主(例如，通过粘膜损伤)，Bacteroides动力学改变可能是这种干扰和随后修复的结果。组织成像显示，链霉素和环丙沙星处理引起的黏液厚度增加(Fig.4)可能影响群落动态，激励未来肠道生物地理学的研究。我们发现了微生物群对抗生素处理反应以及链霉素与环丙沙星之间的几个共同特征。其中最引人注目的是抗生素处理期间细菌负荷的恢复，这是所有六种在拟人化小鼠身上测试的抗生素处理的共同效果(Fig.1B、1F和S7A)。因此，尽管缺乏基于分离细菌株行为的可预测性，但群落特征(如密度)可能具有独立于作用机制的可预测的反应。
Bacteroidetes，特别是S24-7科和Bacteroides是我们研究的重点，因为它具有显著的动态变化。在所有抗生素中，Bacteroidetes的相对丰度要么始终保持不变，要么在转录抑制剂利福西明的情况下，表现出与链霉素和环丙沙星相似的动态(Fig.1C、1G和S7B)。在环丙沙星(Bv，Fig.1H)和克林霉素(B. ovatus，Fig.S7C)中观察到一种优势Bacteroides。根据我们对环丙沙星的分析，我们推测B. ovatus的优势很可能是由其自身对克林霉素的耐药性导致的。尽管如此，在环丙沙星处理期间消除了耐药菌B.salyersiae(Fig.6D)，可能还消除了其他耐药菌群，这推动了今后耐药菌株之间相互作用的研究。当存在泛耐药(链霉素)或可能的泛易感性(利福昔明)时，缺乏单一Bacteroides的优势表明，只要竞争环境是公平的，共存就会在扰动期间保持。就像我们发现了一组与宿主的饮食无关，可以在环丙沙星作用下存活的核心物种(Fig.5H)，在我们的初步研究中，10只中至少5只小鼠体内出现了24个ASVs核心，day3它们占了70.4%±13.1%的菌群，而Bacteroides或S24-7占了88.6%±6.0%(Fig.S7D)。这些数据表明，特定的种间相互作用通常建立了对干扰的恢复能力，而对S24-7和Bacteroides的关注很可能对其他抗生素是有保证的我们的结果表明，在抗生素实验中必须谨慎。在链霉素等的病例中，重要的是要采取高频率采样以捕获细菌负荷和组成的巨大变化(Fig.1B和1C)。更早的采样可以捕获抗生素的潜在影响，如甲硝唑，在我们的试点中显示出了显著的弹性(Fig.S7A和S7B)。我们在链霉素期间的成分结果在性质上与以前的一些研究一致，但与其他人不同，这也许反映了微生物特异性或笼养效应。通过对喂养环境组成和设施的控制，我们的实验设计使我们能够明确地确定饮食(Fig.5)和合住(Fig.7)在微生物群对抗生素的反应中的关键作用。我们的发现具有广泛的转化应用意义。用于16S分析DADA2错误校正方法学提供了抗生素期间某些类群所经历的不确定的多样性损失的严格算法(Fig.2G-2I)，与基于OTU筛选的方法不同，OTU筛选的方法意味着数百种物种仍然存在(Fig.S2G)并且在环丙沙星处理期间未发现Bv的优势(Fig.1H)。在使用抗生素之后，细菌的多样性似乎长远地消失了(Fig.2、5和S3)，这反映了敏感的Bacteroidetes物种的灭绝。这些物种的移植可以加速处理后微生物群的恢复；例如,Bacteroides可以转移到Bacteroides缺乏的宿主上(Fig.6)。一些细菌类群的消失可以为条件致病菌打开生态位，这突出了自体粪便移植和/或靶向微生物处理对恢复定殖耐药性的重要性。MAC缺乏饮食使微生物群对环丙沙星敏感(Fig.5)，并可能增加病原体入侵的可能性。在未来的研究中，探索饮食干预(例如，高纤维)是否能提高弹性和恢复力，如逆转难辨梭状芽胞杆菌的持续感染，将是很有趣的。我们的实验表明，抗生素也可以为未来的干预研究校准微生物菌群，比如在第一次处理中，H2小鼠体内的拟杆菌如何增加，从而在第二次处理中加速了快速恢复(Fig.6D和6I)。我们的研究强调了常规小鼠和拟人化小鼠反应的相似性，例如Bv株在两种定植状态下的恢复过程中的优势。尽管如此，一些观察表明，常规小鼠对环丙沙星处理比拟人化小鼠更敏感。首先，在处理期间，传统小鼠的可培养密度基本上没有恢复(Fig.3E)，这可能是由于在整个处理期间均缺乏Bacteroidetes(Fig.3)。第二，与拟人化小鼠相比(Fig.2B和S3B)，传统小鼠(Fig.S3D)的α多样性下降幅度更大且时间更长。最后，传统小鼠对第二次处理反应与第一次处理反应一致(Fig.3E和3F)，而拟人化小鼠对第二次处理的反应更有弹性(Fig.3B和3C)。尽管这种恢复力可能是由于在拟人化微生物群中出现了耐药菌株，但值得注意的是，在整个第二次处理期间，科水平的丰度几乎保持不变(Fig.3F)。拟人化小鼠缺乏完整的免疫功能可能是造成这些差异的部分原因。尽管如此，我们的数据表明，人类微生物群对抗生素的耐受性可能比小鼠更强，这与STD喂养传统小鼠相比，环丙沙星对MD喂养传统小鼠造成的破坏显著增加是一致的。
抗生素处理与其他常见的肠道微生物群干扰有着令人惊奇的共性。抗生素和渗透性腹泻均显示S24-7的敏感性(Fig.1G、5D和5G)，其与Bacteroidaceae竞争肠道生态位，在恢复中的关键作用(Fig.7)和转变在本质上改变了的稳定状态(Fig.3)。对链霉素、环丙沙星和利福昔明的反应有惊人的相似性(Fig.1C、1G和S7B)，提示一种模式化的微生物坍塌机制(Fig.1B)。然而，单笼饲养的小鼠之间异质性的增加(Fig.7)表明，崩溃和恢复可能依赖于在大量灭绝后无法维持的相互作用。我们的发现描绘了一个微生物群落的图景，它随着饮食、抗生素和成分的整体变化而改变，但如果这个群落能够通过环境介导的再殖民得到加强，它就会表现出恢复力。未来研究如何在多个时间尺度上研究微生物群落对扰动的响应，这将使绘制群落状态和轨迹的图谱成为可能，从而帮助设计有弹性的群落和重新规划生态失调。
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