编译：萌依依，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
出生后宿主-微生物的相互作用控制着粘膜的动态平衡，并被认为具有终生影响健康的效应。肠道单层上皮在早期生命过程中起着至关重要的作用，然而，口腔多层上皮的作用仍不明确。我们证明，与肠道不同的是，新生儿口腔被大量的微生物群定植，在断奶期间这些微生物群会下降到成人水平。中性粒细胞在出生前存在于口腔上皮中，出生后暴露在微生物群中，通过γδT17细胞进一步将它们招募到前导新生儿上皮。这些中性粒细胞在断奶过程中几乎消失了，因为上皮被封闭了。新生上皮和成年上皮表现出明显的周转动力学和转录特征。断奶过程中由于微生物群上调了唾液产量和诱导产生唾液抗菌成分使得微生物减少。总体而言，出生后多层上皮和微生物群之间独特的相互作用促成了口腔内环境的稳定。
原名：Maturation of the neonatal oral mucosa involves unique epithelium-microbiota interactions
译名：新生儿口腔粘膜的成熟涉及独特的上皮-微生物群相互作用
期刊：Cell Host & Microbe
IF：15.923
发表时间：2021.1
通讯作者：Hovav Avi-Hai
作者单位：以色列Hebrew大学
图文摘要
1 针对从出生到成年的口腔微生物群进行菌群分析和体外培养量化。
2 集中分析了新生儿口腔和牙龈上皮中T细胞的频率和IL-17水平。
3 进一步评估口腔上皮的功能，检测其通透性、唾液抗菌成分及周转率。
4 对SPF和GF小鼠口腔上皮细胞进行RNA-seq，以了解微生物群对上皮细胞的功能影响
1 口腔微生物群大量定殖在新生儿的上皮细胞，但在断奶期间下降，同时经历了明显的多样性变化
为了解微生物群与口腔免疫系统之间的关系，我们首先描述了从出生到成年的口腔微生物群。如图1A所示，出生后一周和两周后，口腔中的大量细菌在出生后第三周显著减少，在生命第四周达到成年微生物负荷水平。我们对培养的厌氧菌和好氧菌进行了量化，发现1周和2周大的小鼠的菌落形成单位 (CFU)明显高于4周或8周大的小鼠 (图1B)。图1C显示，在1周大的小鼠中，Pasteurellacea科 (Proteobacteria门) 构成口腔细菌的大多数，而Streptococcaceae科(Firmicutes) 代表第二大种群。在生命的第三周和第四周(即断奶期) ，口腔微生物群经历了实质性的变化，因为Streptococcaceae科在物种数量上超过了Pasteurellaceae科。α多样性分析证实，与1周龄的小鼠相比，3到4周龄的小鼠具有更高的类群丰富度 (图1D)。此外，如未加权的b-多样性所示，这些小鼠体内存在的分类群明显更加多样化(图1E)。
图1.口腔微生物群在新生儿口腔上皮中大量定植，但在断奶后下降到成年水平(A)条形图显示每组r16S基因水平。(B)口腔需氧菌和厌氧菌总数的CFU数据。给出了三个独立实验之一的代表性数据。(C)饼状图表示分配给每个细菌家族的序列的平均分布。(D)代表不同样品中类群丰富度的α多样性图。(E)基于不同年龄小鼠16S rRNA的加权UniFrac距离的主坐标分析。2 中性粒细胞在出生前就存在于口腔上皮中，并且在出生后以微生物群和IL-17依赖的方式被额外但短暂地招募。由于新生儿口腔被细菌大量定植，我们考察了具有抗菌能力的白细胞在生命早期是否存在于口腔上皮中。如图2A和2B所示，中性粒细胞在1周龄小鼠的颊上皮中很容易被检测到，而在4周龄和8周龄小鼠的口腔上皮中几乎没有中性粒细胞。出生一周后，在牙龈上皮细胞中也发现了中性粒细胞，但中性粒细胞主要存在于成人牙龈上皮中(图2A、2B和S1a)。然后，我们检测了上皮中IL-17的水平，因为这种细胞因子被认为介导了中性粒细胞的招募。事实上，IL-17在一周大的小鼠的颊上皮和牙龈上皮中表达上调 (图2C)。IL-17在口腔上皮细胞中的表达下降到成人的基础水平，而在牙龈中的表达的第三周(即牙齿萌出过程中) 进一步增加，然后逐渐下降到成人的水平。与这些结果一致的是，在1周龄和8周龄的IL-17-/-小鼠的颊上皮和牙龈上皮中没有发现中性粒细胞 (图2D)。在1周龄和8周龄的无菌 (GF)小鼠的口腔上皮中，中性粒细胞也显著减少，而在牙龈中仍能检测到中性粒细胞 (图2D) 。在E17.5胚胎的上皮中能检测到 中性粒细胞 (图2E和2F)。此外，与颊粘膜相似，中性粒细胞存在于1周龄小鼠的舌上皮中，但在成年小鼠中不存在 (图2E和2F)。
图2.中性粒细胞以IL-17和微生物群依赖的方式暂时招募到新生儿的口腔和牙龈上皮(A)荧光激活细胞分类(FACS)图显示了出生后1、4和8周口腔和牙龈上皮中中性粒细胞和单核细胞的频率。(B)用针对Ly6G (红色) 和DAPI (蓝色) 的单克隆抗体(mAbs)对1周龄和8周龄小鼠的口腔和牙龈进行免疫荧光整体染色，以进行核显影。(C)各时间点IL-17mRNA在牙龈和颊上皮中表达的动态变化。(D)FACS图显示1周龄和8周龄SPF，GF，Il-17-/-的小鼠颊部和牙龈上皮中中性粒细胞和单核细胞的频率。(E)E17.5、1周龄和8周龄小鼠舌上皮中性粒细胞和单核细胞的频率(F)来自1周龄和8周龄Ly6G-cre/tdTomato小鼠、Ly6G (红色)和DAPI (蓝色) 舌上皮层的免疫荧光整体染色。(G) CD11b+Ly6G+细胞 (中性粒细胞) 与CD11b+Ly6Gneg细胞(从1周龄小鼠舌上皮分离) 对吞噬FITC-珠子能力的流式细胞仪图谱。(G)从1周龄小鼠舌上皮分离的CD11b+Ly6G+细胞(中性粒细胞) 对CD11b+Ly6G+细胞吞噬FITC-珠子的能力。(H)中性粒细胞相关基因Ly6G正常化后，NOS2 mRNA在1周龄和8周龄小鼠颊和牙龈上皮中的表达。3 γδT17细胞是新生儿口腔上皮中产生IL-17的主要T细胞IL-17的产生可以由各种类型的细胞诱导，特别是CD4+αβT细胞(Th17)和γδT17细胞(γδT17)。因此，我们检测了新生儿口腔和牙龈上皮中这些细胞的频率，发现在1周龄的颊上皮和牙龈上皮中γδT17细胞的水平高于其他CD3+T细胞(图3A)。其次，对T细胞的体外刺激显示γδT17细胞是新生儿上皮中唯一表达IL-17的亚群(图3B)。事实上，γδT17细胞在1周龄的颊上皮和牙龈上皮中约占IL-17的产生CD45+细胞的90%，在成人上皮中占70%；这些细胞中的大多数也是CD44hi (图3C)。相反，αβT细胞在新生儿上皮中不能产生IL-17，在成年上皮中，它们只占IL-17细胞的10%。在排出口腔粘膜的颈部淋巴结(LNS)中，γδT17细胞也是1周龄小鼠产生IL-17的主要T细胞亚群(图3D)。然而，在成年小鼠中，这种细胞因子主要由αβT细胞产生，γδT17细胞的相对比例降低。通过向Tcrd-GDL小鼠注射白喉毒素有条件地消融γδT细胞可以减少颊上皮中IL-17的表达，也证明了它们是这种细胞因子的主要来源(图3E)。我们进一步鉴定了胚胎发育期间舌上皮中的γδT17细胞，它是早期唯一的T细胞亚群(图3F)。
图3. γδT细胞代表1周龄小鼠颊上皮和牙龈上皮中产生IL-17的主要细胞(A)1、4和8周龄小鼠颊上皮和牙龈上皮中γδT细胞的平均值的FACS曲线图和条形图。(B)从颊上皮分离的γδT细胞和CD4+T细胞在刺激下产生的胞内IL-17和IFN-γ(C)直接体外分析牙龈γδT细胞中IL-17的产生。条形图显示γδT细胞和αβT细胞占总IL-17+细胞的百分比，IL-17+细胞占CD44hiγδT细胞的百分比。(D)条形图显示颈淋巴结中γδT细胞和αβT细胞占总IL-17+细胞的百分比。(E)成年Tcrd-GDL小鼠注射白喉毒素。(F)3天后，舌上皮细胞中IL-17a mRNA的表达有代表性的流式细胞仪(FACS)图显示舌上皮中存在γδT细胞。4 新生儿口腔上皮在出生后的成熟过程中以微生物群依赖的方式变得缺乏通透性。口腔粘膜的组织切片显示，上皮在出生后逐渐增厚，并变得更加角化，在出生后约4周显示出与断奶时期相对应的成年特征(图4A)。为了进一步评估口腔上皮的功能，我们检查了它的通透性，我们使用了FITC(图4B)或甲苯胺蓝(图S3)来检测上皮对小分子的渗透性。在4周大的小鼠中观察到较少的通透性，而在成年小鼠中，FITC主要定位于上皮的外表面(图4B)。与上述通透性研究一致，这claudin 4 (Cld4)和紧密连接蛋白1 (Tjp1，即ZO-1蛋白)两个基因的mRNA水平在4周龄的小鼠上皮中比在1周龄中上调，并且Cld4的表达在8周龄的小鼠中进一步增加(图4C)。ZO-1和Cld4的免疫荧光染色进一步证实了这些分子在蛋白水平的表达逐渐增强(图4D)。通过使用GF小鼠，我们进一步证明了微生物群是有效关闭上皮所必需的，因为FITC比SPF小鼠更多地穿透成年GF的颊上皮(图4E)。
图4. 新生儿的上皮在出生后成熟过程中是封闭的。(A)1、4和8周龄小鼠上颌骨和颊部横切面的组织学染色。(B)上述年龄组小鼠的颊部横切面显示，将FITC溶液局部涂抹在颊粘膜上可见FITC在组织中的定位。(D)用针对ZO-1(绿色)、claudin 4(红色)和Hoechst(蓝色)的mAbs对1周龄、4周龄和8周龄小鼠的口腔粘膜横截面进行免疫荧光检测。(E)成年GF和SPF小鼠的口腔横切面和图表显示了应用FITC时的定位和荧光强度，(E)成年GF和SPF小鼠的口腔横截面和图表显示了应用FITC时的定位和荧光强度。(D)用抗ZO-1(绿色)、claudin 4(红色)和Hoechst(蓝色)的mAbs检测1、4和8周龄小鼠口腔粘膜横截面的免疫荧光。5 出生后唾液分泌上调减少口腔微生物群，而微生物群诱导唾液抗菌成分的表达在缺乏IL-17和野生型(WT)对照的1周大小鼠的口腔中发现了类似的微生物群负荷(图5A)。如图5B所示，10天大的小鼠的唾液产生率明显低于3周大的小鼠，在此期间观察到微生物负荷急剧减少(图1A和1B)。腮腺组织学分析显示，与10日龄小鼠相比，3周龄小鼠的成熟腺泡数量更多，间质更少(图5C)，这与前者分泌唾液的能力增强相一致。腮腺切除三天后，发现自然唾液产量显著减少(图5D)，随后口腔细菌负荷增加(图5E和5F)。此外，作为识别不同细菌家族的核糖体16S基因的特异引物，微生物群被失调，显示Streptococcaceae科(Firmicuts)减少，而Prevotellaceae科(Bacteroidetes)扩张(图5G)。接下来，我们检查微生物群是否对唾液有影响，我们发现成年GF小鼠和SPF小鼠的唾液分泌率相似(图5H)。尽管考马斯蓝染色显示的唾液总蛋白含量在这些小鼠之间似乎是相似的(图5I)，但GF小鼠的唾液不含IgA或IgG，并且由水平降低的放线菌素相关抗菌肽(Cramp，小鼠与人LL-37的同源物)组成(图5J)。
图5.口腔微生物群在断奶过程中由于唾液产量的上调而减少，而唾液中的抗微生物成分是由微生物群(A)诱导的，条形图表示野生型或IL-17-/-小鼠中的细菌负荷。(B)曲线图显示10日龄、3周龄和8周龄小鼠的唾液分泌率。(C)10日龄、3周龄和8周龄小鼠腮腺切片HE染色。(D)对完整的成年B6小鼠或切除腮腺3天后的唾液进行定量。(E和F)曲线图以平均值+SEM(n=5)表示完整和切除腮腺一周后口腔可培养细菌总数(F)的相对细菌载量(E)和菌落总数(CFU)。(G)手术后3周接受腮腺切除术的小鼠体内各种细菌家族的绝对丰度。(H)成年SPF和GF小鼠的唾液分泌率。(I)考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶，含成年SPF和GF小鼠的唾液样本。(J)免疫印迹检测成年SPF和GF小鼠唾液中IgA、IgG和CRAMP。6 与成体上皮相比，新生儿上皮的周转率较慢，并有明显的转录特征。如图6A和图6B所示，新生小鼠和成年小鼠注射BrdU+细胞后5h就在上皮基底层检测到BrdU+细胞，在成年小鼠上皮中，标记细胞迅速到达基底层，并在一周后消失(图6A和6B)，这与之前关于成人口腔上皮周转率的报道一致，而且新生小鼠BrdU+细胞相对于起始点的比例在7、10和14天时显著高于起始点。如图6E所示，基因集富集分析(GSEA)显示，与一周龄小鼠相比，免疫途径如干扰素(IFN)-g、IFN-α、IL6/JAK/STAT3、IL-2/STAT5和炎症信号通路是显著上调的途径。
图6 新生上皮在出生后逐渐被替换，并获得成年上皮(A和B)的转录特征。给5日龄或成年小鼠注射一次BrdU。具有代表性的图像显示了BrdU+细胞在上皮中的定位；白线虚线表示基底膜。(B)曲线图显示每个时间点上皮BrdU+细胞的数量，以及剩余BrdU+细胞与较早时间点的比率。分离1周龄和8周龄小鼠的(B-D)上皮细胞，进行整体基因表达分析。(B)1周龄和8周龄颊上皮细胞差异表达基因的系统聚集性。(C)不同上皮细胞亚群表达的最可变转录本的PCA。(D)GSEA分析发现1周龄和8周龄上皮细胞的基因通路显著上调和下调。7 微生物识别受体和抗菌分子在新生儿和成人上皮中的差异表达Tlr2在1周龄小鼠的颊上皮和牙龈上皮中表达上调，然后恢复到基础水平(图7A)。然而，免疫荧光染色显示了一种相反的模式，因为Tlr2蛋白在1周龄的小鼠上皮中不存在，但在4周龄和成年小鼠中清晰可见(图7B)。值得注意的是，TLR2蛋白的表达被微生物群上调，因为与成年SPF小鼠相比，GF组的TLR2蛋白显著减少(图7C)。我们还检测了细胞间模式识别受体Nod2的表达，发现出生后表达增加，类似于Tlr2和Myd88 (图7A)。我们发现Cramp在产前有相当高的表达水平，之后降低，在出生后4周达到成年表达水平(图7D)。然而，如图7E所示，新生儿上皮中Cramp mRNA水平的升高并没有导致比成人上皮中更高的抽筋蛋白水平。然而，β-defensin4和β-defensin14(Defb4和Defb14)的表达在出生后逐渐上调，并在断奶前后达到成年mRNA的水平(图7F)。为了了解微生物群对上皮细胞的影响，我们对8周大的SPF和GF小鼠口腔上皮细胞进行了分类，并对它们进行RNA-seq实验。如图7G和7H所示，等级聚类和PCA分析显示SPF小鼠和GF小鼠上皮细胞的转录特征有显著差异。GSEA分析确定了在SPF小鼠中显著上调的各种途径，包括免疫途径(例如，IFN-g和IFN-a信号)以及各种细胞过程，如细胞周期、生长、新陈代谢和增殖(图7I)。值得注意的是，与GF小鼠相比，SPF小鼠上皮细胞中显著下调的途径是EMT途径，这与后者发现的上皮通透性增加是一致的(图4D)。
图7.微生物识别受体和抗菌分子在新生儿和成人牙龈上皮中的差异表达(A)出生后不同时间口腔和牙龈上皮中上述基因的相对表达。图表显示实时荧光PCR定量的转录本水平，并归一化到8周龄的小鼠。(B)用针对TLR2(绿色)或MyD88(红色)和Hoechst(蓝色)的mAbs对1、4和8周龄小鼠的口腔粘膜横截面进行免疫荧光观察。(C)用针对TLR2(绿色)和Hoechst(蓝色)的mAbs检测SPF和GF小鼠口腔和牙龈横切面的免疫荧光。(d和F)产前和产后不同时间口腔和牙龈上皮中CRAMP蛋白(D)和b-defensins和14(F)的相对表达。(E)Western blot检测1周龄、4周龄和8周龄小鼠上皮中的CRAMP情况。(G)8周龄SPF和GF小鼠口腔上皮细胞差异表达基因的等级聚类。(C)不同上皮细胞亚群表达的最可变转录本的PCA。(D)GSEA分析发现，8周龄SPF口腔上皮细胞与GF口腔上皮细胞之间的基因通路显著上调和下调。这项研究阐明了出生后在多层口腔上皮中发生的免疫功能事件，以响应第一次接触微生物群的反应。口腔微生物群的建立与肠、肺微生物群的建立有很大不同。另一方面，在口腔中，Firmicutes和Actinobacteria在新生儿和成人中都是最常见的门，尽管在断奶过程中细菌多样性有很大的变化。其他工作也报道了这两个门在成年小鼠口腔中的优势。这些都表明环境因素和新生儿时期的定植对成人口腔微生物群的关键影响。新生儿口腔上皮中中性粒细胞的存在可能会使上皮通透性增加，并为暴露在高微生物负荷下的脆弱组织提供保护。然而，这一策略是口腔粘膜独有的，因为在新生儿的肠或肺上皮中并没有发现中性粒细胞。口腔上皮可能提供了中性粒细胞更为宽松的环境，大量的中性粒细胞穿过口腔上皮进入唾液。这种活性被认为在调节体内的中性粒细胞稳态中发挥作用。然而，在颊上皮和舌上皮中，中性粒细胞暂时被招募到新生儿上皮中，似乎起到了保护作用，因为它们具有抗菌能力。在这方面，微生物群被证明能在出生后1-3天诱导循环中的中性粒细胞快速分化，这些中性粒细胞具有完整的吞噬和产生活性氧的能力。中性粒细胞在新生儿口腔上皮的募集很可能是由Vg6+γδT17细胞介导的。我们最新发现Vg6+细胞是成人口腔上皮中IL-17的主要来源，在胚胎发生期间种植上皮，并在出生后以微生物群依赖的方式扩张。在这里，我们进一步证明了γδT细胞占新生儿口腔上皮中IL-17产生细胞的90%以上，最近发现Vg6+细胞是出生后口腔上皮中唯一存在的γδT17亚群。αβT细胞(Th17)产生IL-17只在成人上皮中被检测到，并且主要是由咀嚼力而不是微生物群诱导的。这些上皮细胞在咀嚼过程中受到破坏，进一步证明了口腔上皮在生命后期也具有关键的免疫功能。虽然新生儿口腔上皮细胞高度增殖，但新生儿口腔上皮的周转率远低于成人口腔上皮，这是在断奶后实现的。这突显了与肠道的根本不同，在肠道中，新生儿上皮细胞的增殖速度比成年细胞慢，但在断奶期间，肠道中新生儿上皮向成年上皮的过渡也在发生。这种反差的增殖率可以用每个组织中不同性质的上皮(即单层和多层上皮)来解释。这种耐受性反应涉及新生儿肠道的活跃机制，而且TLR信号可能在口腔粘膜中也受到积极抑制，因为TLR2的mRNA水平在1周大的上皮中最高。
总之，这项研究描绘了微生物群和口腔上皮在出生后第一次相遇时的相互作用，这对建立口腔粘膜稳态至关重要。了解这种早期机制对人类健康很重要，因为这种发育过程的缺陷可能会在成年生活中转化为口腔或全身性疾病。
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