WB常见问题及处理方法

1．电泳中常出现的一些现象：

●︶ 条带呈笑脸状

原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏高。

●︵ 条带呈皱眉状

原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

●拖尾

原因：样品溶解不好。

●纹理（纵向条纹）

原因：样品中含有不溶性颗粒。

●条带偏斜

原因：电极不平衡或者加样位置偏斜。

●条带两边扩散

原因：加样量过多。

2．Western blot结果中背景较高

可能的原因及建议：

●膜封闭不够

延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。

●一抗稀释度不适宜

对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。

●一抗孵育的温度偏高

建议4℃结合过夜。

●选择的膜容易产生高背景

一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低。

●膜在实验过程中干过

实验过程中要注意保持膜的湿润。

●检测时曝光时间过长

减少曝光时间。

3．Western blot结果中杂带较多

可能的原因及建议：

●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

●目的蛋白有其它剪切本

查阅文献或生物信息学分析可能性。

●样本处理过程中目的蛋白发生降解

加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。

●上样量过高，太敏感

适当减少上样量。

●一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体。

●一抗不纯

纯化抗体

●一抗或者二抗浓度偏高

降低抗体浓度。

4 . Western blot结果中无信号或显示信号弱

可能的原因及建议：

●检测样本不表达目的蛋白

选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。

●检测样本低表达目的蛋白

提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。

●转移不完全或过转移

可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。

●抗体不能识别测试种属的相关蛋白

购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

●一抗孵育时间不足

建议4℃结合过夜。

●二抗与一抗不匹配

选择针对一抗来源的种属的抗体。

●洗膜过度

洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。

5. 其它现象：

●膜上多处出现黑点或黑斑

原因：抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。

●反白（条带显白色）

原因：目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。

●蛋白分子量偏低或偏高

原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

6．安全问题：

操作有毒试剂时，带手套和口罩，且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。