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这篇文章来自南京医科大学第二附属医院肿瘤医学中心于2020年3月19日发表在Molecular Therapy上题为“Integrative Analysis of NSCLC Identifies LINC01234 as an Oncogenic lncRNA that Interacts with HNRNPA2B1 and Regulates miR-106b Biogenesis”的文章。
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长链非编码 RNA (lncRNA) 的发现增加了我们对许多癌症发生和进展的了解，但它们对非小细胞肺癌 (NSCLC) 的贡献仍知之甚少。作者在 NSCLC 中鉴定了许多表达失调的 lncRNA，并证明了一个新的致癌调控轴，涉及 LINC01234、HNRNPA2B1、miR-106b-5p、CRY2 和 c-Myc，这可能是 NSCLC 的潜在新靶点。
为了鉴定 NSCLC 中差异表达的 lncRNA，作者首先下载并分析了来自癌症基因组图谱 (TCGA) 的肺腺癌和肺鳞状细胞癌 RNA 测序 (RNA-seq) 数据集以及来自 GEO 的微阵列基因谱数据集：GSE31210 和 GSE18842（图 1A、1B）。在所有四个数据集中分别鉴定了 46 和 23 个被显著下调和上调的 lncRNA（图 1C）。进一步分析了上调的 lncRNA，在 23 个 lncRNA 中，LINC01234 差异最大，TCGA 泛癌分析显示LINC01234 在许多其他类型的癌症也是过表达（结肠腺癌、食管癌、多形性胶质母细胞瘤、肾嫌色细胞、肾透明细胞肾癌、乳头状肾细胞癌、肝细胞癌、前列腺腺癌、甲状腺癌和子宫体子宫内膜癌）（图 1D）。为了验证这些结果，进行了荧光原位杂交 (FISH) 分析，并证实了与相邻正常组织相比，LINC01234 在 NSCLC 肿瘤中的异常过表达（图 1E）。同样，对 95 对 NSCLC 和正常组织的qRT-PCR分析表明，LINC01234 在 78% (74/95) 的癌组织中显著上调。NSCLC 细胞系中 LINC01234 表达的分析给出了类似的结果（图 1F）。接下来，通过将 95 个标本分配到高（n = 50，倍数变化 > 2.5）和低（n = 45，倍数变化 < 2.5）两个LINC01234 表达组来探讨 LINC01234 表达与 NSCLC 患者临床病理特征之间的关系（图1F）。Kaplan-Meier 生存分析显示，高表达与低表达 LINC01234的 肿瘤患者相比，3 年总生存率和无进展生存率 (PFS) 较低（图 1G）。
为了探索 LINC01234 在 NSCLC 中的生物学功能，作者用小干扰 (si)-LINC01234、非靶向对照 siRNA (si-NC)、LINC01234 过表达载体或空载体，转染 A549 和 SPC-A1细胞（图 2A）。MTT增殖实验表明，与对照细胞相比，LINC01234 的下调显著抑制了NSCLC 细胞增殖，相反，LINC01234 过表达促进了细胞增殖（图 2B、2C）。类似地，克隆形成实验表明，LINC01234 的敲低或过表达分别显著降低或增加了克隆存活潜力（图 2D）。当使用 EdU测定法测量细胞增殖时，获得了类似的结果。由 si-LINC01234 表达诱导的细胞增殖受阻伴随着细胞在 G1 至 G0 期停滞（图 2E）和细胞凋亡水平升高，正如使用 TUNEL 染色或流式细胞术测定所测量的（图 2F）。因此，敲低LINC01234 的 A549 和 SPC-A1 细胞表达显著升高水平的凋亡相关蛋白，包括裂解的PARP和caspase-3，表达显著降低水平的G1/S期分界点蛋白，如细胞周期蛋白 D3、细胞周期蛋白 D1 和细胞周期蛋白依赖性激酶 2 (CDK2)（图 2G）。这些数据表明，LINC01234 在控制 NSCLC 细胞增殖、细胞周期进程和细胞凋亡中起着至关重要的作用。为了在体内验证这些发现，采用了小鼠异种移植模型，将稳定表达的对照或 LINC01234 特异性短发夹 RNA (shRNA) 的 A549 细胞注射到无胸腺裸鼠皮下，并监测肿瘤生长 18 天。结果显示，源自 sh-LINC01234 细胞的肿瘤比源自 sh-NC 对照细胞的肿瘤小（图 2H、2I）。通过 qPCR 分析证实 LINC01234 表达在切除的肿瘤中受到抑制。通过免疫组织化学 (IHC) 和 TUNEL 染色评估，与对照肿瘤相比，sh-LINC01234 衍生的肿瘤表达较低水平的增殖标志物 Ki-67，并含有更多的凋亡细胞（图 2J）。
为了更好地了解 LINC01234 的潜在作用机制，作者检查了其在 NSCLC 细胞中的分布和相互作用的蛋白。通过 FISH 分析确定 LINC01234 RNA 位于细胞核和细胞质中（图 3A）。RNA pulldown结合质谱法鉴定了 NSCLC 细胞裂解物中的 HNRNPA2B1与生物素化的 LINC01234 RNA 结合，但不与反义 RNA 结合（图 3B）。生信分析显示，LINC01234 相互作用蛋白在 mRNA 代谢、RNA 剪接和 RNA 加工通路中富集（图 3C）。据报道HNRNPA2B1通过调节前体 mRNA 加工和 miRNA 成熟参与多种癌症的发展。RNA pulldown分析证实了 LINC01234 和 HNRNPA2B1 之间的特定关联，表明 HNRNPA2B1 与生物素化 LINC01234 RNA 结合，而不与生物素化阴性对照或反义 RNA 结合（图 3D）。使用截短的 LINC01234 序列（1-500、1-1000、1-1500 和 1-2088bp）进行的类似实验表明，NSCLC 细胞中的主要 HNRNPA2B1 结合位点位于 LINC01234 的 1000-1500 序列中（图3E）。相反，使用 RNA 免疫沉淀 (RIP) 分析在 A549 和 SPC-A1 细胞的 HNRNPA2B1 免疫沉淀物中鉴定出 LINC01234。LNMAT2 被用作 RIP 检测中的阳性对照（图 3F）。LINC01234 和 HNRNPA2B1 的相互作用因 LINC01234 沉默而减少（图 3G）。这些结果表明 LINC01234 与 HNRNPA2B1 形成复合物，可以调节下游靶标表达。
研究表明，HNRNPA2B1 可以与DGCR8（初级 (pri)-miRNA 微处理器的一个组成部分）相互作用，并调节 miRNA 表达。为了在 NSCLC 细胞中证实这一点，作者通过蛋白质印迹分析，对内源性DGCR8 和 HNRNPA2B1进行了相互免疫沉淀，并证实这两种蛋白质在 NSCLC 细胞中相互作用，而si-LINC01234 的表达消除了这种结合（图 3H）。这些数据表明，LINC01234 通过与 HNRNPA2B1 和 DGCR8 形成复合物在 pri-miRNA 加工中发挥作用。
为了确定 LINC01234 是否以 HNRNPA2B1 依赖性方式影响 pri-miRNA 加工，作者对沉默了 LINC01234 和/或 HNRNPA2B1 的 A549 细胞进行了全局 miRNA 分析。通过敲低 LINC01234 或 HNRNPA2B1（图 4A），细胞中大量 miRNA 的表达降低，其中 38 个 miRNA 在 LINC01234 和 HNRNPA2B1 沉默的细胞中下调（图 4B）。
在 LINC01234 和 HNRNPA2B1 沉默的 A549 和 SPC-A1 细胞中，通过对五种下调幅度最大的 miRNA——miR-106b-5p、miR-17-5p、miR-362-5p、miR-374-3p 和 miR-425-3p 的初级和成熟形式进行 qPCR 分析。结果显示成熟 miRNA 的水平因 LINC01234 或 HNRNPA2B1 敲低而降低，而其 pri-miRNA 的水平增加（图 4C），表明加工过程受到阻碍。pri-miR-106b 和 miR-106b-5p 发生了最显著的变化，因此猜想HNRNPA2B1 和 DGCR8 是否与 NSCLC 细胞中的 miR-106b 相互作用。作者发现 pri-miR-106b 富含 NSCLC 细胞裂解物的抗 HNRNPA2B1 和抗 DGCR8 免疫沉淀物（图 4D），并且这种关联因 LINC01234 敲低而降低（图 4E）。总之，这些数据表明 HNRNPA2B1 和 DGCR8 可以与 pri-miR-106b 相互作用，LINC01234 在 HNRNPA2B1 和 DGCR8 的帮助下促进其成熟为 miR-106b-5p。
NSCLC 和邻近正常肺组织中 HNRNPA2B1 蛋白表达的 IHC 分析表明，该蛋白在肿瘤组织中异常上调（图 5A），与 LINC01234 的上调一致。为了研究 LINC01234、HNRNPA2B1 和 miR-106b-5p 在 NSCLC 细胞中的生物学作用和相互依赖性，作者分析了它们的调节对细胞增殖、凋亡和细胞周期进程的影响。表达 si-HNRNPA2B1 的细胞的 qRT-PCR 分析证实，与表达 si-NC 的细胞相比，HNRNPA2B1 mRNA 水平特异性降低了约 80%。通过 MTT 和集落形成实验评估，HNRNPA2B1 敲低显著抑制了 A549 和 SPC-A1 细胞的增殖（图 5B 、 5C），此外还诱导了 G0/G1 期的细胞周期停滞和细胞凋亡增加（图 5D、 5E）。与 LINC01234 的发现一致，HNRNPA2B1 支持 NSCLC 细胞的生长。
此外，用 miR-106b-5p 抑制剂转染 A549 和 SPC-A1 细胞可降低细胞增殖（图 5F 、5G），诱导细胞周期停滞在 G0/G1，并增加细胞凋亡（图 5H、5I）；而将 miR-106b-5p 模拟物共转染到 A549 细胞中可部分挽救LINC01234 敲低的影响（图 5J、5K），表明 LINC01234 的增殖作用部分是通过 miR-106b-5p的上调介导的。
为了确定LINC01234–HNRNPA2B1–miR-106b-5p 调控的下游靶基因，对表达 si-LINC01234 或 si-NC 的 A549 细胞进行了RNA-seq，分析差异表达的 mRNA（图 6A）。集富集分析显示，LINC01234 沉默影响了在与细胞周期停滞和凋亡相关的通路中富集的基因的表达。为了识别 miR-106b-5p 和 LINC01234 共调节的目标，对 miRDB 数据库和基因表达谱进行了综合分析，发现在通过 LINC01234 沉默显著上调的 997 个基因中，16 个是 miR-106b-5p 的预测靶基因（图 6A）。其中，生物钟蛋白 CRY2，因其在 LINC01234 敲低时显著的表达倍数变化及其在肿瘤抑制中的重要作用而受到特别关注，因此选择它进行进一步分析。为了验证 CRY2 表达确实通过 LINC01234 和 miR-106b-5p 进行调节，进行了荧光素酶报告基因检测，发现 miR-106b-5p 显著降低了由 WT-CRY2（CRY2 的野生型3' 非翻译区）驱动的荧光素酶活性，而不是由 mut-CRY2（在预测的 miR-106b-5p 结合位点突变一个碱基）驱动的（图 6B），表明 CRY2 表达受 miR-106b-5p 调节。与此一致，qRT-PCR 和蛋白质印迹分析表明，用 miR-106b-5p 模拟物和抑制剂转染后，CRY2 mRNA 和蛋白质水平分别降低和升高（图 6C）。
鉴于 LINC01234 和 miR-106b-5p 的表达在 NSCLC 细胞中呈正相关，预测 LINC01234 敲低可能重现 miR-106b-5p 对 CRY2 表达的影响。事实上，si-LINC01234 表达显著增加了 A549 和 SPC-A1 细胞中 CRY2 mRNA 和蛋白质水平（图 6D），并且这些影响被 miR-106b-5p 模拟物的共表达逆转（图 6E）。此外，CRY2 的过表达逆转了 miR-106b-5p 模拟物的增殖作用（图 6F、 6G），证实了 LINC01234–HNRNPA2B1–miR-106b-5p 轴在 NSCLC 细胞中负调节 CRY2 的表达和功能。由 miR-106b-5p 过表达诱导的 CRY2 mRNA 和蛋白质的下调也部分通过与 CRY2 载体的共转染来挽救（图 6H）。最后，通过分析肺腺癌和肺鳞状细胞癌 TCGA 数据集，确定了 miR-106b-5p 和 CRY2 mRNA29 的表达水平之间的显著负相关（图 6I）。总的来说，这些数据表明CRY2是miR-106b-5p的靶基因，其在NSCLC细胞中的表达受LINC01234和miR-106b-5p的共同调控。
为了验证 CRY2 作为肿瘤抑制因子的潜在作用，作者检查了它在 NSCLC 组织和细胞中的表达和功能。IHC 分析和 TCGA 分析表明，与正常肺组织相比，肿瘤组织表达的 CRY2 水平较低（图 7A）。正如预期的那样，用 CRY2 过表达载体转染 A549 和 SPC-A1 细胞显著抑制细胞增殖（图 7B、7C），这与 LINC01234/miR-106b-5p 过表达的影响形成对比。为了确定操控CRY2的水平是否可以逆转 LINC01234 的作用，作者用 CRY2 和 LINC01234 的过表达或 siRNA 载体共转染 NSCLC 细胞，发现 CRY2 部分逆转了 LINC01234 过表达的增殖作用，相反si-CRY2 的表达在很大程度上挽救了 LINC01234 敲低诱导的生长抑制（图 7D、7E）。
有研究显示，CRY2 促进 c-Myc 降解，因此CRY2 敲低可以稳定 c-Myc 蛋白水平。与此一致，作者发现 CRY2 过表达和 LINC01234 敲低降低了 NSCLC 细胞中的 c-Myc 蛋白水平，而 LINC01234 过表达增加c-Myc 水平（图 7F、7G）。NSCLC 患者数据集的 Kaplan-Meier 分析表明，CRY2 的低肿瘤表达与较差的预后相关（图 7H）。因此，LINC01234 和 miR-106b-5p 正调节 c-Myc 表达并通过负调节 CRY2 水平促进 NSCLC 生长。
在证明了 NSCLC 细胞中 LINC01234-miR-106b-5p-CRY2 和 c-Myc 之间的关系后，作者提出 c-Myc 或其他转录因子是否可能导致在 NSCLC 中观察到的 LINC01234 表达失调。通过在线数据库 JASPAR，发现 LINC01234 启动子区域包含几个潜在的转录因子结合位点，包括 c-Myc（图 8A）。此外，RNA-seq 数据的基因集富集分析表明 c-Myc 调节的基因在非小细胞肺癌中受 LINC01234 表达差异调节的基因中富集（图 8B）。同时，在 GEO：GSE18842 肺癌数据集中观察到 LINC01234 和 c-Myc 表达之间的显著正相关（图 8C）。这些发现表明 c-Myc 可能是 LINC01234 的上游调节剂。为了验证这一假设，在 A549 和 SPC-A1 细胞中过表达或沉默 c-Myc，并分析了 LINC01234 的表达，发现 c-Myc 过表达或敲低分别增加或减少了 LINC01234 表达（图 8D）。为了确定 c-Myc 是否调节 LINC01234 表达，进行了染色质免疫沉淀 (ChIP) 和荧光素酶报告基因检测，发现与 NSCLC 细胞裂解物的对照免疫球蛋白 G (IgG) 免疫沉淀物相比，LINC01234 启动子序列确实富含抗 c-Myc 免疫沉淀物（图 8E），并且荧光素酶报告基因检测鉴定了LINC01234 启动子 E2（-373 至 -362）和 E3 的（-40 到 -29）区域作为特定的 c-Myc 结合位点（图 8F）。最后，作者检查了 NSCLC 肿瘤中 c-Myc 表达与患者预后之间的关系，发现 c-Myc 过表达肿瘤患者的总生存率较低。总的来说，这些结果表明 LINC01234–HNRNPA2B1–miR-106b-5p–CRY2–c-Myc 通路的表达和活性在 NSCLC 的发展和进展中发挥作用（图 8G）。
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