吲哚菁绿荧光成像在腹腔镜肝脏外科手术中的应用
作者：张中林,李晓勉,李锟,唐胜利,杨智勇,常磊,刘志苏,袁玉峰
文章来源：中华肝胆外科杂志,2019,25 (2)
资料与方法
1．患者临床资料：
武汉大学中南医院肝胆胰外科2016年9月—2018年10月共实施68例ICG荧光引导腹腔镜肝脏手术，其中3例患者中转开腹(2例因术中出血、1例因严重腹腔粘连)，其余65例成功实施ICG荧光成像引导下腹腔镜肝切除手术。患者中男26例，女39例，平均年龄54.7(31.0～80.0)岁。病理分布：肝恶性肿瘤43例，包括原发性肝癌31例(肝细胞癌23例，肝内肝管癌及混合癌8例)，继发性肝癌12例(乳腺癌肝转移3例、结直肠癌肝转移5例、卵巢癌肝转移1例、胃癌肝转移3例)；肝良性病变22例，包括肝血管瘤5例、肝囊肿4例、肝脏局灶性结节增生(FNH)1例、肝内胆管结石12例(左肝内胆管结石11例，右肝内胆管结石1例)。29例(44.6%)患者合并乙肝肝硬化。
患者纳入标准：术前肝功能储备评估及肝体积评估结果显示残余肝体积在安全范围，重要脏器功能良好，能够耐受手术操作，肿瘤影像学评估无肝外转移，具备腹腔镜下可切除性等。排除标准：年龄大于80岁，肝功能Child C级或MELD评分>15，残余肝体积不足，肝外转移，肾小球滤过率<55 ml/min，怀孕或哺乳期，甲状腺功能亢进，对碘剂或ICG过敏等。
2．ICG荧光材料及操作方法：
(1)荧光手术系统：采用加拿大Pinpoint Novadaq腹腔镜荧光成像系统。该系统可呈现LED可见光和近红外激光双光源的内窥镜影像，与荧光造影剂ICG配合使用可提供高清白光、黑白荧光和绿色荧光3种成像模式。
(2)注射用ICG由卫材(辽宁)制药有限公司生产。
(3)术前与术中ICG注射的剂量：术前B超、CT或MRI及临床综合评价患者肝功能及肝硬化状态，根据肝硬化状态于术前1～7天内经外周静脉注射ICG(剂量0.5 mg/kg)，同时完成ICG检测。需详细记录每例患者ICG注射距手术时间间隔，并记录ICG 15 min滞留率(ICG R15)。术中尝试不同剂量(0.0025～0.05 mg/kg)ICG经外周静脉或目标肝段Glisson鞘静脉注射，观察荧光成像效果。
(4)术中ICG成像的方法：结合术中ICG注射实施目标肝段显影(正显影或负显影)，以进行解剖性肝段或肝叶切除。具体方法包括两种：①术中目标肝段正显影法：即通过向目标肝段肝蒂门静脉注射ICG实现成像。方法是通过术中解剖目标肝蒂后，或直接在超声引导下穿刺所在门静脉，根据肝段体积大小缓慢注射ICG 0.025～0.05 mg/kg，结扎或不结扎相应肝段或肝叶之肝动脉。②负显影法：即通过ICG着色目标肝段或肝叶以外的肝脏。术中解剖目标肝段或肝叶的肝蒂，并阻断Glisson鞘(经鞘外阻断)后经外周静脉注射ICG。
由此，目标肝段以外的肝脏因ICG蓄积而呈绿荧光，而目标肝段无荧光，术中藉此荧光分界线引导肝实质离断。
3．手术方式：
根据肿瘤性质，大小、数目及位置分布，肝功能储备等综合评估，制定个体化手术方案。手术方式包括肿瘤局部切除、解剖性肝段/亚段/联合肝段切除以及非解剖性的区段切除等。拟行解剖性肝段切除的全部患者，均在术中行ICG注射，尝试在ICG正显影或负显影的荧光引导下行腹腔镜肝切除术，记录显影效果、手术时间、出血量等。
结果
2．ICG使用剂量、注射时间与荧光成像效果：
本组中术前ICG注射的使用剂量为0.5 mg/kg。为实现肝段或肝叶荧光显影导航下解剖性肝切除或肝血管瘤、肝囊肿剥除术，我们尝试经外周静脉注射或直接将ICG注入目标肝段根部门静脉，结果显示0.025～0.05 mg/kg剂量即可在肝脏正显影和负显影中达到满意效果，部分患者在低至0.0025 mg/kg剂量亦可满足手术需要的ICG荧光效果。
3．ICG荧光对肿瘤病灶的识别：
原发性和继发性恶性肿瘤患者术前影像学提示的全部近肝表面结节，均在术中荧光腹腔镜下得以识别和确认。术中在普通白光下不易识别而通过荧光发现的病灶8枚(图1)，经切取后送病理学检查，其中2枚证实为肿瘤性病变(原发性肝癌和乳腺癌转移瘤各1枚)，占术中意外发现荧光病灶25%(2/8)。另6枚证实为汇管区组织慢性炎症并胆管增生(图2)，其在术中荧光显像被认为是肝内局部微胆管扩张并局限性胆汁淤积所致。此外，肝脏表面微小囊肿、部分肝硬化结节、肝脏局灶性结节增生等也在术中荧光融合中表现为局灶性绿色荧光结节。
4．不同病理类型及分化程度下的ICG荧光特点：
肿瘤结节的病理类型、分化程度及荧光特点见表2。本组肝细胞肝癌患者23例，共检测30个结节。胆管癌及混合性肝癌患者8例，共检测17个病灶。中高分化肝细胞癌、肝硬化结节及FNH表现出亮绿荧光，低分化肝细胞癌及胆管细胞癌本身不荧光，环周肝组织多成荧光状态(环状荧光)。我们发现肿瘤的周边肝段可能因肿瘤侵犯相应胆管系统而致异常荧光。
术前注射ICG后肝血管瘤及肝囊肿无荧光，但是术中注射ICG 2～10 min后，因背景肝组织的ICG荧光而使得肝血管瘤呈负显影状态。本组纳入的肝脏继发性肿瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌肝转移等，均能在肝脏表面呈现出对比度较好的亮荧光，但当肿块较大并突出肝包膜时，因肿块本身缺乏荧光而呈现出环状荧光状态。
5．ICG荧光引导的腹腔镜肝切除术：
68例患者中，共3例中转开腹：1例右后叶S6肝癌因治疗侵犯肾上腺及后腹膜，术中出血中转开腹；1例腹腔镜解剖性右半肝切除，移除标本后因肝断面渗血中转开腹止血；1例右后叶肿瘤术后患者因腹腔粘连中转开腹。其余患者均于腹腔镜下完成肝切除手术，其中32例患者实施ICG荧光腹腔镜下解剖性肝段或肝叶切除术，手术方式见表3。本组统计正显影的成功率70.6%，负显影的整体成功率46.7%，总体ICG荧光肝段显影成功率59. 4%。其中，19例患者成功施行ICG目标肝段显影(正显影)或非目标肝段显影(负显影)。
手术平均时间200 min(40～500 min)，平均出血量200 ml(30～600 ml)。2例患者术后出现肝断面膈下积液，1例患者术后断面胆汁漏，1例胆管结石性左半肝切除＋T管引流患者术后T管脱落、胆汁漏，经引流后好转。患者术后平均住院时间5.2 d(2～9 d)。
6．ICG荧光技术在肝内胆管结石手术中的应用：
肝内胆管结石患者若局部肝胆管引流胆汁不畅，可致局部胆管或肝段荧光延迟消退。ICG荧光还有助于胆漏的识别，可用于手术过程中引导识别及切除病损胆管(图3)。患者肝内胆管结石见局部胆管扩张荧光，与相邻正常肝组织形成显著对比。
讨论
ICG作为一种近红外荧光染料，注入体内后可与血清白蛋白结合并被肝细胞摄取，在750～810 nm波长的外来光源照射下可透过组织产生近红外光，通过特殊的接收装置可显示肝胆结构。ICG荧光引导下的肝脏手术中，ICG的使用剂量目前并无统一标准。术中通过外周静脉注射ICG实施目标肝段或肝叶显影的效果，与目标肝段的容量体积、肝功能状态以及胆汁排泄通畅与否等因素密切相关。为实现肿瘤显影，术前经外周静脉途径注射给药，多数文献的经验性使用剂量为0.5 mg/kg，亦有0.25 mg/kg。ICG的使用剂量并非在药理学允许范围内越大越好，剂量过大容易导致目标肝段/肝叶的界限浸染，更可因二次循环致全肝染色而导致手术失败。
根据肝脏的病理学状态确定术前ICG注射时间同样至关重要。并发显著肝硬化或梗阻性黄疸的患者，ICG在肝内蓄积时间延长。若术前注射时间间隔不充分，则可致ICG在肝脏没有充分廓清，背景肝脏或肝硬化结节出现显著荧光，与目标病灶间失去应有的荧光对比度而导致荧光导航失败。
本组通过观察术前不同时间点注射ICG的荧光成像效果发现，术前<48 h给药的荧光成像失败率非常高，有肝硬化患者几乎不能成功。因此建议，术前ICG注射至少应在术前3天，有显著肝硬化者应至少延长至术前4～5天，但需注意过长的时间间隔可能致目标病灶ICG消退，故不建议超过一周。而在术中经外周静脉注射ICG数分钟后肝脏即可在荧光腹腔镜下呈现荧光，2 h左右达峰。本组观察显示多数患者的荧光效应可至少持续6～8 h。因此，就其持续时间而言，该方法能够满足绝大多数肝脏手术需求。
肝脏肿瘤本身或肿瘤生长可导致局部微胆汁排泄环境改变。术前一定时间内经静脉注射ICG后，经一定时间的代谢、待背景肝脏ICG蓄积消退后，肿瘤局部仍可保持相对荧光。这一特性可被用来引导手术，特别是用于术中肿瘤定位、识别及保证充分切缘。
本组统计分析了原发性肝脏肿瘤和继发性肝肿瘤患者的荧光显影特点，发现两者均在荧光腹腔镜下显现出特异性荧光，并各有特点：中高分化肝细胞性肝癌的肝细胞分化相对成熟，具备摄取ICG能力，而肿瘤实质内则缺乏正常肝组织内胆汁排泌系统，致使肿瘤剖面多呈现均质性荧光的特点；FNH、肝硬化结节组织分化成熟，ICG荧光成像特点与中高分化肝细胞癌相似。低分化肝癌肝细胞呈幼稚状态，肝内胆管细胞癌(ICC)则不具备肝细胞成分，两者肿瘤实质均不具备ICG摄取功能，而肿瘤膨胀性生长又导致相邻肝组织内微胆管系统受压致胆汁排泌不畅，故均呈环状荧光。
由此类推，混合型肝癌因肝细胞癌成分所占的比例及分化程度不同而可能表现出不同的荧光特点。乳腺癌、结直肠癌、胃癌、卵巢癌发生肝转移时，肝转移瘤在表浅临近肝包膜或完全突出于肝表面时，呈环状荧光特点；若肿瘤临近肝表面而仍有浅层肝组织覆盖、肿瘤被推挤的肝实质完全包绕时，则呈均匀荧光状态。当肿块较大并突出肝包膜时，因肿块本身缺乏荧光而呈现出环状荧光状态。最近有研究认为，不成熟肝细胞增多以及多药耐药相关蛋白2(MRP2)表达受损，也可导致吲哚菁绿在肿瘤周围肝脏组织沉积。
我们还发现，术中肝脏病灶染色的情况，还与肿瘤累及胆管并导致胆汁引流受阻情况有关。对本组患者研究发现，肿瘤生长侵犯某肝段，引流胆管或者局限性结石致肝内胆管受阻等因素均可导致该肝段胆汁引流障碍，进而导致区域ICG荧光较背景肝脏延迟消退，与相邻正常肝组织形成显著对比由此可用于手术过程对肝段或病损胆管的识别及切除引导。肝血管瘤内部结构松软呈海绵状，肝囊肿内充满囊液，两者不像肝癌等肝实体肿瘤那样挤压周围组织形成明显的环状荧光带，当术中注射ICG时不显影，与周围荧光的背景肝组织形成显著对比(即负显影状态)。有报道术中ICG注射后能够对肝内胆管结石进行良好显示，减少手术时间，不损伤胆管，且技术简单。
ICG荧光腹腔镜系统在对肝脏结节的发现方面具有较高的敏感性，但荧光对肝组织的穿透性有限。文献报道术前给药荧光显像可探测到距肝表面8～10 mm的肿瘤。因此，ICG荧光对发现肝脏表面潜在肿瘤结节，包括对小的播散灶或转移瘤的发现，具有一定的价值。术前影像及术中超声均不易呈现靠近肝包膜的微小病灶，ICG荧光系统相较之下具有显著优势。本组数例肝脏多发转移瘤及原发肿瘤中都发现了新的病灶，部分为肝脏离断过程中偶然发现，术后病理仅部分证实为肿瘤病变，且有较高假阳性率。
我们推测为临床上肝内局部微胆管扩张并局限性胆汁淤积所致。导致肝内异常局灶性荧光的因素众多，肝脏表面微小囊肿、肝硬化结节、FNH等也可在术中荧光融合中表现出局灶性荧光。本组数据样本较少，且未对肝硬化与非肝硬化背景做研究分层，但是初步提示该技术仍不失为术中发现与识别肿瘤肝内转移的一种有效手段。
术前ICG注射引导的肿瘤荧光显像，在肝切除手术中确保足够的切缘，降低切缘阳性率，获得更好肿瘤学效益等方面，已获国内外文献的广泛认可。我们体会术前ICG注射引导的肿瘤荧光显像，对肿瘤深在的中央区或右后区肝脏手术具有特别重要的价值。中央区深部肿瘤，或者位置深在的右后区肿瘤，即使结合术中超声，切肝过程中仍存在深部肝组织中不易定位、容易偏离的难题，若结合术中ICG荧光，则可实现实时定位肿瘤，避免切少(切破肿瘤或切缘不足)或切多(误切可保留或必须保留的重要管道)的危险，从而提高肿瘤根治性和手术安全性。
通过ICG荧光引导实施解剖性肝切除手术是近年来肝脏外科的重要进展之一。理论上，解剖性肝切除术中切除了肿瘤及所在肝段，清除门静脉分支区域潜在的微病灶，较非解剖性肝切除在降低术后复发上应该更具有优势。然而，肝脏段－段间分界线并非规则线形，即使采用术中超声定位肝静脉和入肝血流阻断制造表面缺血线，也很难实现真正意义上'精准'的解剖性肝脏离断。既往有学者尝试术中超声引导或直接穿刺门静脉注射美蓝染色，但存在染色时间短、易洗脱的问题。而解剖Glisson鞘后经门静脉注射ICG使得目标肝段在荧光镜下呈绿色荧光显影的方法(正显影)，与相邻肝段之间产生荧光分界线，且过程中无需阻断肝动脉，荧光显色持久，可实现腹腔镜手术断肝过程的离断平面的全程化、立体化引导。与之对应，解剖目标肝段Glisson蒂后行鞘外阻断，出现缺血线，而后经外周静脉注射ICG，可实现目标肝段以外肝脏的荧光着色，与目标肝段间产生荧光分界线，借此也可实现肝段的解剖性切除，即所谓'负显影'。
我们认为，该方法的优点是手术解剖操作更简单，对血管穿刺要求低，缺点是非目标肝段肝容积分布较广，解剖学上血流交通复杂，易于和目标肝段间形成交通支，导致正显影的染色失败率更高。值得注意的是，目标肝段的完全性鞘外阻断，而非仅鞘内结扎门静脉，有助于提高染色的成功率。
总之，ICG荧光肝段标记导航的肝切除技术，结合术中超声及血流阻断，可使肝脏外科手术实现前所未有的接近真正意义上的'精准解剖性切除'。但是，由于肝脏解剖学上天然分布的众多肝段变异，不管采用哪一种ICG肝段显影方法，均有成功率限制。ICG荧光技术在肝脏外科手术中的应用也存在诸多问题有待于解决：一是虽然肝脏ICG显影敏感，但肝脏小囊肿、硬化结节、FNH等出现的非特异性荧光显像十分普遍，小结节假阳性率高，是ICG应用过程中面临的困惑之一；二是ICG在肝脏中的摄取与分布受诸多因素影响，荧光边界浸染显像非常普遍，二次循环分布亦可导致肝脏区域荧光差异降低；三是虽然术中ICG注射荧光有可识别术中胆漏的优点，但时有肝断面浸染导致胆漏识别效率不高甚至无法识别的问题；四是ICG代谢受肝脏代谢差异的影响，如何根据肝功能状态按剂量精准给药，以达到最佳荧光成像效果，也是临床应用中面临的问题；五是受解剖因素影响，肝段或肝叶血供与循环差异导致肝段或肝叶染色成功率有限。因此，只有将各种手段综合而合理的运用，才有助于发挥ICG荧光引导肝脏外科手术的最大价值。
参考文献【略】