研究生文献解读|胎球蛋白-A是缺氧应激时保护组织完整性的HIF靶点
文献
信息
标题：Fetuin-A is a HIF target that safeguards tissue integrity during hypoxic stress
期刊：Nature Communications
第一作者：Rudloff S
单位：伯尔尼大学医院肾脏病和高血压科
出版时间：2021.01.22
doi：10.1038/s41467-020-20832-7
文献链接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-20832-7
科学问题：探究胎球蛋白-A在缺氧应激时作用
导
读
胎儿宫内生长受限(IUGR)与出生时肾脏体积变小、加速肾功能下降以及增加成人慢性肾脏和心血管疾病的风险有关，但是其确切机制还不清楚。Rudloff S建立低氧诱导的胚胎宫内发育迟缓小鼠模型，通过研究胚胎在mRNA、蛋白质和细胞水平的适应性，发现Fetuin-A是一个进化保守的HIF靶基因并对其功能进行了深入研究。
引
言
成人疾病的胎儿起源假说认为怀孕期间的不良事件会导致低出生体重，并增加成年后患病风险。胎儿宫内发育迟缓与许多不利的妊娠条件有关，其中宫内缺氧起着重要作用。对高原居民的人口研究发现，高海拔与肾脏疾病的发病率有显著的相关性。虽然已经提出了许多理论，但低氧引起肾脏疾病发生和发展的确切机制仍有待确定。
本研究通过建立IUGR小鼠模型，通过对全基因组表达水平的分析，鉴定了血浆糖蛋白胎球蛋白-A(Ahsg)是一个进化保守的HIF靶基因，并利用胎球蛋白-A KO小鼠进一步研究了其在缺氧胎肾中的作用。
研究
方法
1.小鼠胚胎慢性缺氧模型：10%O2，E14.5-E18.5
2.处理方式
对照组（21%O2）；低氧组（10%O2，E14.4-E18.4）；卡路里控制组（Cc组，给常氧小鼠喂食与低氧组小鼠进食量相匹配的食物）
3.研究方法
基因阵列，RT-qPCR，流式细胞术，分子克隆，荧光素酶测定，整装原位杂交，TUNEL染色，免疫组化，免疫荧光染色，酶联免疫吸附试验（ELISA），Westernblot分析等
研究
内容
1.IUGR小鼠模型的建立与验证
2.基因阵列检测胎肾的全基因组表达与RT-qPCR验证
3.胎球蛋白-A在胎肾中的定位
4.体外实验表明缺氧在体外能激活Fetuin-A转录
5.胎球蛋白-A缺乏会加剧缺氧性IUGR导致的慢性肾脏疾病
6.胎球蛋白-A通过减弱缺氧诱导的纤维化标志物的表达和减轻胚胎缺氧时促炎M1巨噬细胞的浸润和极化来对肾脏起保护作用
7.补充胎球蛋白-A可减少肾脏缺血再灌注损伤时纤维化标志物的表达
研究
结果
01
小鼠胚胎慢性缺氧模型的建立与验证
为了建立慢性胚胎缺氧模型，将妊娠小鼠于妊娠期第14.5至18.5天暴露在10%O2中（Fig.1a）。研究发现，缺氧组母鼠在整个妊娠期间的摄食量比常氧组减少了8.6%（Fig.1b），建立Cc组以排除研究结果可能不是由于缺氧，而是由于摄入的卡路里减少的原因。结果发现缺氧组的E18.5胚胎表现出低出生体重，而Cc组没有（Fig.1d）。另外通过评估经典的缺氧诱导靶基因EPO在胚胎肝脏样本中的mRNA表达水平发现它的转录在缺氧组中几乎是对照组的四倍，从而证实了慢性缺氧确实激活了胎儿中HIF靶基因的转录。
跟踪低氧和常氧组的产仔数显示，每窝产仔数是相当的，并且在整个哺乳阶段保持不变，且在生存评估中没有发现明显的差别（Fig.1f），但发现后代出生后在性别、基因型和实验方面存在显著差异，包括明显的低氧组幼崽的追赶生长（Fig.1g）。
02
在缺氧胚胎肾脏中诱导的胎球蛋白-A对发育中的肾脏具有局部的、重要的保护作用。
使用基因阵列检测缺氧胚胎肾脏的全基因组表达，与两个对照组相比，有62个上调基因和28个下调基因（Fig.2a） ，其中有超过20%的上调基因经常从钙蛋白颗粒(CPPs)中纯化出来，包括CPP的主要成分fetuin-A(Ahsg)等。
通过选择基因的RT-qPCR验证微阵列数据证实，只有在缺氧胚胎肾脏中有四倍以上的诱导，但在肝脏和对照组肾脏中没有上调（Fig.2b-c）。上调率最高的基因Ahsg(>10倍)属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂的半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族，编码阴性的急性时相糖蛋白胎球蛋白-A，其主要功能与矿化基质代谢有关。
虽然Ahsg在低氧胎肾中显著上调，但其血清胎球蛋白-A水平并没有比对照组显著升高（Fig.2d-e）。这是因为在正常情况下，肝脏是循环Fetuin-A的主要来源(比胚胎肾脏高600倍)，而胚胎低氧模型中肾脏局部的“异位”胎球蛋白-A表达水平仍然比肝脏低60倍。这证明在缺氧的胚胎肾脏中诱导胎球蛋白-A不具有系统功能相关性，而是对发育中的肾脏具有局部的、重要的保护作用。
03
胎球蛋白-A是在缺氧条件下在近端小管局部产生的
为了进一步解决胚胎缺氧肾脏中Ahsg表达的功能相关性，因此对它的精确定位进行确定。
整体原位杂交显示，胎球蛋白-A mRNA在缺氧胚胎肾脏皮质区域合成，但在正常缺氧肾脏中不合成(补充图4a-b)。胎球蛋白-A免疫荧光染色将其更精确地定位于外肾皮质，恰好在肾区下方(补充图4c)。免疫组化显示在胚胎肾近端小管(PT)(Fig.3a，c，e，g)或小管腔(Fig.3b，d，f，h)。通过各种方法以及胎球蛋白-A和不同肾段标志物的双重免疫荧光染色(Fig.3i-x)证实胎球蛋白-A仅在缺氧胎肾的甲状旁腺中表达。
04
缺氧在体外激活胎球蛋白-A转录，促进胎儿器官纤维化标志基因的表达。
通过荧光素酶实验确认胎球蛋白-A是一个进化保守的依赖于缺氧诱导因子的靶基因（Fig.4a-b）。
此外，缺氧不仅促进胎球蛋白-A的表达，而且还刺激了几个纤维化标志基因在原代小鼠PT细胞(Fig.4c)、胚胎肾脏(Fig.4d)和胚胎肺和心脏的表达。
05
胎球蛋白-A缺乏加剧了缺氧性IUGR导致的慢性肾脏疾病
测定成年野生型(Wt)和胎球蛋白-A(Ahsg)KO小鼠(Fig.5a-b)的尿蛋白水平和肾小球滤过率(GFR)显示与对照组相比，9周龄的Ahsg KO动物和胚胎期缺氧的小鼠的GFR降低，而蛋白尿严重增加。对纤维组织重塑的评估显示在低氧条件下的Ahsg KO小鼠的肾脏中胶原蛋白表达水平最高(Fig.5c-e)，在组织学检查中有多个胶原束延伸到更深的皮质下区域(Fig.5f-i)。这些结果表明，Ahsg KO小鼠的肾功能受到的影响最大，表现出缺氧和胎蛋白A功能的相加效应。
06
胎球蛋白-A通过拮抗转化生长因子-β信号减弱缺氧诱导的纤维化标志物的表达
用新鲜分离的原代小鼠PT细胞（pPTCs）进行体外实验发现，在培养基中添加胎球蛋白-A可以钝化缺氧诱导的纤维化标志物基因表达水平的增加（Fig.6a-d），在蛋白质水平上也观察到了这种减弱效应(Fig.6e)。转化生长因子β-1（Tgfb1）是一种有效的纤维化诱导剂(Fig.6f)；用重组Tgfb1-Smad1刺激pPTCs后，其细胞内信号转导因子Smad3被强烈磷酸化(Fig.6g)，与wt细胞相比，Ahsg KO pPTCs中的这种激活是wt细胞的三倍多(Fig.6h)，表明Ahsg KO细胞对转化生长因子-β1的反应更强烈。这些结果提示胎球蛋白-A通过直接拮抗转化生长因子-β1信号来减轻缺氧引起的肾纤维化。
07
胎球蛋白-A可减轻胚胎缺氧时促炎M1巨噬细胞的浸润和极化
巨噬细胞是引起肾损伤的另一种重要细胞类型，根据其极化程度进一步分为促炎M1细胞或抗炎M2细胞。使用流式细胞仪对E18.5缺氧性或常氧性胎肾的巨噬细胞群进行研究发现虽然大多数巨噬细胞在正常缺氧的肾脏中是M2极化的(CD206+)，但从缺氧肾脏分离的大多数巨噬细胞已经适应了M1的促炎表型，且M1极化巨噬细胞的比例在缺氧的Ahsg KO样本中更为突出(Fig. 7)。
这表明缺氧促进了促炎症的M1巨噬细胞(CD206−)在肾脏的浸润和极化，提示胎球蛋白-A与整体抗炎环境有关。
08
补充胎球蛋白-A可减少缺血再灌注损伤时纤维化标志物的表达。
缺氧性Ahsg KO肾脏炎症表型增强的一个原因可能是肾脏钙化，因为胎球蛋白-A KO小鼠容易软组织钙化。通过将新鲜切开的E18.5胚胎的肾脏切片与ATTO 488荧光标记的胎球蛋白-A(488-FA)孵育来探索含钙微粒的存在。488-FA染色显示常氧大鼠肾脏的PT强烈标记，这是一个主要的钙吸收部位（Fig.8a)，PT染色强度在低氧WT中降低，在低氧Ahsg KO中增加(Fig.8b-c)。只有缺氧的Ahsg KO肾脏在乳头区也显示颗粒状染色，在外皮层的肾生生区较少见(Fig.8f，I中的箭头)，表明在没有内源性胎球蛋白-A的情况下有大量的矿物质沉积。这些数据说明了胎球蛋白-A在肾脏矿化基质结合和清除中的作用。
使用小鼠缺血再灌注损伤(IRI)45模型进行研究发现IRI肾脏的组织损伤与含钙微粒的沉积有关(Fig.8k)，这在对照组中没有发现(Fig.8j)，此外，在IRI手术后每天服用胎球蛋白-A 4天，与生理盐水治疗的小鼠相比，其Col1a1和Col3a1的表达显著减少(Fig.8l，m)。
这些证据表明，在损伤时补充胎球蛋白-A可能是一种很有前途的治疗方法，可以对抗缺氧诱导的矿物质应激和纤维组织重塑，特别是在与胎球蛋白-A耗竭相关的情况下，如慢性肾脏病或急性炎症。
讨
论
1.Fetuin-A(Ahsg)是一个进化保守的HIF靶基因，通过抑制细胞碎片介导的矿化，以及巨噬细胞极化和纤维化重塑来保护肾脏免受缺氧所致的肾损伤。
2.不同的缺氧性IUGR模型会出现不同的成年表型，这可能是由于不同缺氧方案，特别是低氧时间、低氧暴露开始时的发育阶段或低氧的严重程度的差异导致的。
3.鉴于肝脏和肾脏的大小相差四倍，以及这两个器官在胎球蛋白-A分布中所起的作用(肝脏将胎球蛋白-A释放到血液循环中供全身使用，而肾脏在缺氧损伤时产生的胎球蛋白-A只起局部作用，与全身无关)，该研究认为肾脏中局部产生的胎球蛋白-A浓度足够高，就足以产生显著的肾脏保护作用。
结
论
该研究提出了一个模型（Fig.9）：胎球蛋白-A(Ahsg)是一种缺氧诱导因子(HIF)靶基因，可局部保护肾脏免受缺氧所致的肾损伤和功能恶化，它的功能与清除钙化纳米颗粒、减轻炎症、减轻纤维化组织重塑和巨噬细胞极化有关。
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理由
该研究是系统且严谨的，从基因组数据中筛选到目的基因，并不断提出猜想并通过实验加以验证，这种研究思路值得借鉴，有些方法值得我们学习。
”
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”
编者信息
解读人
乔聪聪
郑州大学生命科学学院
2019级生物学专业
硕士研究生
校正人
王馨蕊
郑州大学生命科学学院
2018级动物学专业
硕士研究生