微藻培养：基础生物学到工程技术(1)

微藻的种类很多自然界中发现的有6万多种，有记录的6000多种，常用的几十种。微藻产品价值链非常长，从藻种开始，用什么样的微藻，它具有什么的性质，然后你用什么的培养方法，用什么样的培养技术体系，怎么样回收，怎么样深加工和高值化等一系列的问题，这些问题的解决来实现微藻产品的价值链，通过价值链来实现其价值。这些问题都必须要认真思考，回答这些问题首先就是要清楚微藻的基础生物学。

微藻的基础生物学是工程化的基础。如果没有生物学的理解，透彻认识，工程化也不可能做好。首先就是藻种的性质，藻种的性质主要指它的遗传特性。藻种具有什么的性质，能做什么样的工作，为什么样产业服务，需要什么样的培养体系。需要什么的培养基，如何去培养，这样一些问题的回答的都必须要了解它的遗传特性。第二个方面的就是营养方式，营养方式取决于两个方面，一个是物质，一个是能量。我们吃饭不仅是要提供物质基础，同时也是在提供能量。

对微藻来说有三个方面，一个人就是化能异养，化能异养是指在有有机物，没有光的时候通过氧化呼吸作用来产生能量叫化能异养。光能异养是指同样在有有机物的时候还有光，光可以做能源，这时候的物质还是有机物，能源有两方面，一方面是光合作用，由光能提供能源，另外一方面依然去氧化有机物，因此光合作用和呼吸作用都能产生能量。在没有有机物，只有光时，只能靠光合作用产生能量。物质和能量对于微藻是不可缺少的，必须根据有什么样的物质采取什么样的能量方式，细胞才能正常的生长繁殖。

培养基包括碳、氮、磷及微量元素，从自养的微藻来说，它的培养基主要成分是无机物，如无机碳、无机氮、无机磷及其他元素等。有些微藻可以进行混养生长，也就是光能异养或者化能异养生长，因此其需要有机物，可以利用简单的有机碳、有机氮等。

培养设施通常是细胞生物反应器，如果有光则称为光生物反应器，分为两种情况，一个是完全化能异养的反应容器是发酵罐，发酵罐不仅是金属罐还是玻璃罐基本上是没有光，即使加光也是不同形式的加光或者后来发展成光发酵罐，就可以进行光能异养。通常发酵罐要进行灭菌，有培养基流加，供氧及pH值检测、溶解氧检测等系统。因此发酵罐的系统是工业程度、工业化、自动化程度最高、最有效的，但是并不是所有的微藻都能够进行发酵，能进行发酵的微藻是有限的，几十种。

光能自养的微藻容器是光生物反应器。这时必须要有光源提供能量；还要有碳源，因为碳源没有有机物进行自养，所以其具有二氧化碳或碳酸氢盐等自养体系。有发酵罐可以用，但要选好藻种，另外用光生物反应器要考虑是光能自养还是光能混养。如果是光能混养就要一边给光，一边给添加有机物。有机物是有机氮还是有机碳等都是要考虑的。因此这个基础生物学的性质是工程化的基础。

常见的微藻种类有蓝藻、硅藻、绿藻、隐藻、金藻等，这些藻类都具有不同的用途，在水产养殖和做饵料方面、调水剂方面有不同的用途，针对不同的养殖动物对象采取不同的微藻养殖品种，一定要考虑其遗传特性。一个藻具有什么样的遗传特性，它的营养及生物活性一定是怎么样的情况。螺旋藻主要是高蛋白性质，含有少量的脂肪酸，但其特点是GLA含量较高，其他的类胡萝卜素、叶绿素等都有，但相对含量较低。与小球藻相比，绿藻的特点是含高蛋白，但是其蛋白质含量比螺旋藻低，色素、类胡萝卜素要远远高于螺旋藻。

有些绿藻含有EPA，雨生红球藻含有虾青素，还有些含有多糖。如果做饵料就单一的饲喂小球藻不管是对动物还是对轮虫营养强化时，它的脂肪酸种类不齐全，因为它没有十八碳酸，更长链的脂肪酸，这时由其遗传决定的。硅藻含有大量的EPA，岩藻黄素，昆布多糖等也是由遗传决定的。金藻含有大量的DHA，像等边金藻、巴夫藻都有大量的DHA，贝类和鱼苗基本都是终身需要金藻和硅藻。就是因为其需要大量的多饱和脂肪酸。而给贝类和对虾喂大量的小球藻脂肪酸的种类就不齐全。影响其变态发育，不缺蛋白，缺少的是长链脂肪酸。所以针对不同的饲喂动物，要求的营养成分不同。但这些营养成分对微藻来说是由遗传决定的。

微藻的遗传特性决定营养的特征，像螺旋藻是免疫强化剂，就是因为蓝绿藻含有大量的藻蛋白，其中藻蓝蛋白含量较高。紫球藻是海洋的单细胞红球藻，含有藻蛋白，最大量是藻红蛋白，这也是遗传决定的。硅藻岩藻黄素较高，高于海带的成百上千倍，所以硅藻是生产岩藻黄素最好的品种。但在其他的微藻里，如金藻中也有个别的岩藻黄素，但其含量较低。

微藻多数都是光自养的，就意味着光合作用，光是地球上所有能量的来源，万物生长靠太阳，这是一个千古不变的真理，通过阳光的照射给细胞带来的能量，将二氧化碳同化成碳水化合物，碳水化合物继续转化成各种各样的生化分子。因此微藻的光合作用能够释放氧气，提供充足的氧气给耗养生物来进行生长繁殖，才带来了今天地球上丰富的生态系统。因此，它不仅能够产生氧气，还能生产生物原料，还能够做食品、饲料，还能净化水。微藻在光合作用时主要的能量来源是太阳光。

微藻固碳和固氮的独特优势：微藻通过光合作用后，能固定二氧化碳，产生自身的生物质，同时也能够利用一些小分子有机物，进行异养发酵，这时会释放出二氧化碳，因此微藻的营养特性包括异养、混养和自养。利用的碳源和能源方式不同，但都是需要能量及氮、磷其他元素。通过细胞的生长利用有机碳或者无机碳转化成生物质，生物质里含有油脂、蛋白色素等。生物质可以做各种生产加工的原料，油脂和非油脂可以作为生物原料，非油脂可以做沼气、食品饲料，甚至药品。106份的二氧化碳和16份的硝酸盐加1份磷酸盐加0.05份的硫酸根和130份的水变成1个分子的生物质，微藻的生物质同时释放出144个氧气。因此其光合作用产氧的效率非常高。在设计培养基时，意味着碳足够多，氮至少是碳的15%，磷可以少于1%，也就是培养基中有丰富的氮、磷，没有碳的情况下微藻是不会生长的。

如果有大量的碳，没有氮或者是磷不足，他的生长也受到限制，受到抑制。每吨藻可固定1.83吨二氧化碳，其原理是只要微藻的生物质大量生产，得到的生物质乘以1.83就能固定多少二氧化碳。微藻固碳的本质是让生物量大量繁殖，只要能长出多少生物量就能固定多少碳。直接实现了碳减排。同时对工农业的废弃利用它是可以密结合的。比如养殖业的废水里面含有大量的氮、磷，但缺碳。用畜禽养殖业的废水作为培养基，然后补充二氧化碳，微藻就可以生长了。即结合了碳减排，又结合了氮磷的回收利用。有些工业废水中含有大量的有机物，如发酵工业的废旧培养基和清洗的水中含有大量的有机物，但是含氮量很少。用太阳光能源时，碳固定的效率最高，但对于氮来说利用有机碳，可以进行异养发酵，可以进行光下的混养，将氮转化成蛋白质的效率最高。因此光合固碳和光合固氮这两方面实际上能二氧化碳减排，和氮磷的减排做出直接的贡献，形成一个完整的产业链。

光合作用的本质是产生化学能和还原力。光合能量通过光合膜上的电子传递链把其转化成化学能，化学能是ATP。另一方面产生了还原力（NADPH）,都可以进入到光合固碳的环境中间去，就是碳固定。固定二氧化碳时消耗了ATP和NADPH，因此在有光辐照的情况下产生了还原力和化学能。另外将产生的还原力和化学能还能固氮。这样就实现了物质和能量的传递。

图1

图1是光谱和光质，在平时日常生活中主要是太阳光，太阳光的光谱所看到是全光谱，从紫外光到红外光是非常均匀的，蓝色部分和红色部分占大部分，中间还有绿色部分和黄色部分，对于微藻绿色的光是没有生命活性的，作用较小，但也不能不连续，如果不连续对微藻是不健康的，用太阳光和日光灯的光谱来比，太阳光的光谱又宽又高，而普通的日光灯的光谱是光风较矮，强度较弱，另外蓝光部分较低，红光部分较低，绿光部分会较高。

微藻的光合作用来说效率不高，细胞能长，但是长不好，光的衰减较迅速，LED培藻专用灯和太阳光光谱和普通光的光谱比，光谱远远优于普通日光灯，和太阳光较接近。现在有蓝光、红光、白光等，大部分农业用的红蓝灯珠的LED光进行补光，因为高等植物有组织和器官的分化，有开花、结果、长叶子等过程，但是微藻是单细胞的生物，没有组织器官的分化，因此这种红蓝灯珠的配比实际上是可以调整，但对微藻的必要性不大。只要找到一个全光谱的光源不需要找红蓝灯珠的配比，因为不是高等植物，没有组织器官的分化。

图2

图3

图2是从黑暗无光到慢慢增加光强，到一定时，细胞的光合作用和呼吸作用就达到了一个平衡，在没有光时，细胞主要是进行呼吸，氧化分解细胞内存储的营养物质，供能，提供物质基础和能量。随着光强的增加，光合作用开始发生，达到一定光强时，光合作用与呼吸作用正好能达到平衡，这是称为补偿点。补偿点之上光继续增加，这时细胞以光合作用为主，随着光强继续增加，达到p/biomass，再增加光强时，细胞生长达到最大，细胞不会再继续生长。这时如果继续增加光强甚至细胞的生长还会被抑制，这个抑制是因为光带来的，光太强，这时称为光抑制曲线。p/biomass时就已经达到最大的光生长效率了，继续增加，细胞会由于光照的强度增加，导致细胞内光氧化，细胞膜的色素被降解，细胞变白，这时细胞死掉，唯一的原因是光太强，这时应注意光强不能太强，所以光强主要根据细胞密度讲的，针对光径所说的，10cm的水深、20cm的水深和50cm的水深在同样的光强，每个细胞受到的光辐射是完全不同的，细胞的浓度不同，同样的光强每个细胞受到的光辐射强度也是不一样的。光合作用最好、效率最高的这段就是从补偿点到饱和点之间这段曲线。

在培养微藻的体系中都会用过大棚，室外没有遮栏时，图3，光强较强，如果遮上25%的阳光，光强就会降低。如果在大棚温室中都有遮挡，还会有灰尘的折射和反射，都会使光强降低。也就是说在户外完全没有遮拦时，光强是最高的，在温室中光强最低。这时为了维持最好的光强，至少要考虑的因素有第一是要不要遮光，第二是要不要开补光灯，第三是要不要清理屋顶上的灰尘造成的遮光等。随着光强的变化温度也不同，在户外没有遮拦时因为通风，温度最低；在有遮拦的情况下和它差不多；温室里的温度最高，因为空气流通困难，热散发不出去，所有的能量来源和热都是来自于光。因此要考虑其通风设备是否到位。图4是氧气的产生浓度和饱和度，在户外没有遮拦的情况下产氧最高，在25%遮荫时的产氧最低。Greenhouse里是居中的。实际上三者之间的差别不是很大，主要是针对细胞密度进行控制光强。要维持光强足够又不要产生光抑制，另外产氧的效率及温度也是必须要考虑的，尤其是通风降温装置。搅拌具有传热、传质和散氧的功能，快速搅拌和慢速搅拌的细胞生长效率是不一样的。搅拌的快，细胞在光照的表面上下穿梭的机会多，同时将产生氧气散出去的效率提高，不会产生溶解氧浓度过高产生的反馈抑制，同时也尽可能的增加细胞光照的机会。因此快速搅拌通常消耗率高于慢速搅拌。

无机碳源主要是空气中的二氧化碳，螺旋藻培养基中加的碳源是碳酸氢钠、小苏打、碳酸氢盐。无机碳主要是二氧化碳和碳酸氢盐。如果不加入碳酸氢盐，只靠空气中的二氧化碳是不够的，空气中的二氧化碳在空气中的浓度是0.04%，对微藻培养远远不够，在低二氧化碳浓度下微藻为了生长繁殖，发展出一套二氧化碳浓缩机制，细胞外的二氧化碳浓度低于细胞内的二氧化碳浓度。因此二氧化碳进入细胞内之后通过碳酸脱水霉、碳酸氢盐进入细胞是渗透型的。

一旦进入细胞的第一个屏障，穿过细胞壁进入细胞的肢体空间内，在细胞膜上就具有专有的运输载体。把二氧化碳和碳酸氢盐运进细胞，运输前进入到细胞前是由碳酸脱水霉来实现的。变成碳酸的形式进入细胞后很快就进入合成代谢中了，尤其是二氧化碳，碳酸氢根在细胞内在某些局部的细胞空间又可以被转化成碳，二氧化碳又进入光合系统中，合成淀粉、糖原、多糖。细胞发展出一套利用空气中很稀薄的二氧化碳的浓缩机制，细胞外的二氧化碳虽然只有0.04%，细胞内的二氧化碳远远大于细胞外的二氧化碳。这是绿藻的模式。硅藻、金藻和红藻在二氧化碳浓缩模式略有不同。不同也是由遗传特性决定的。

pH值在一个体系中进去的是二氧化碳，但实际上很快变成碳酸氢盐和碳酸盐。在pH值6.5时，是以二氧化碳的形式为主，但pH值在8.3时，全部转化为碳酸氢盐。pH值在9.5以上时，主要都是碳酸盐。除非个别的极度耐碱的利用碳酸盐，大部分微藻都只能利用二氧化碳和碳酸氢盐作为无机碳。这时补碳注意补到什么程度，让它以二氧化碳的形式存在还是以碳酸氢盐的形式存在。碳酸、碳酸氢根、碳酸根是由于pH值决定了各自的浓度和比例。比如pH值在6.3时，碳酸氢盐和二氧化碳基本上跟占50%，pH值在8.3时，只有碳酸氢盐。

微藻利用的有机碳主要是小分子有机物，异养微藻、混养微藻主要利用的是葡萄糖，葡萄糖是是最高效的有机碳源，除了葡萄糖外，醋酸盐也可以，有的能利用甘油，还有的能利用蔗糖等分子，小球藻只能利用甘油、葡萄糖、醋酸、蔗糖、甘露糖、半乳糖等，但利用效率不同。利用这些简单的有机物通过生化反应过程，最终合成油脂、甘油三酯、脂肪酸等成分。通过TC循环，呼吸产生ATP能量物质和中间的一些代谢产物。因此能够利用有机碳源都可以进行混养和异养。小球藻的混养要大于异养。通常对于不同的微藻有一个基本规律就是混养的生长速率等于自养的生长速率加异养的生长速率。微藻要混养，因为生长快，所需要的条件不苛刻。要求光强不高。培养微藻的环境因素有温度、光强和盐度的范围。硅藻、三角褐指藻和骨条藻等喜欢低温，金藻、绿藻等能耐高温。三角褐指藻等的光强为2000-5000lx，绿藻和金藻喜欢强光。螺旋藻最耐高温最适条件为35~38℃。角毛藻在25℃左右，小球藻在25~28℃，金藻在十几度。螺旋藻最适的盐度是16.8g/L，角毛藻28-30g/L，金藻是15-25mg/L等。

培养基的配方：不同培养基的品种可以选择不同的原料进行搭配，如果能够异养或者混养进行培养的微藻可以简单的有机物葡萄糖、蔗糖等碳源来做；如果是自养型，只能利用二氧化碳和碳酸氢盐。对于氮磷没有很多的选择，比如酵母膏、酵母水解物等，最简单的有机物是尿素，其他的氮都属于无机氮。镁非常重要，有些培养基缺镁，叶绿素的合成不充分，细胞偏黄，补充镁后颜色偏绿。配硫酸亚铁和其他微量元素时，建议用酸水来配，酸水是1升的水加1毫升的，酸。这样不容易氧化。

氮源的种类（C-169），筛选若干种氮源，长得最好的氮源是硝酸钾，尿素较好。硝酸钾是无机氮，pH值相对较高，尿素是最简单的有机氮。碳酸氢铵和氯化铵是最不利于生长的，氯化铵这样的氮源碱性离子用掉后剩下的是强酸根，所以pH值一直在下降，如果用硝酸钠、硝酸钾这些硝酸根利用后留下的是钠和钾，pH值一定会上升。因此选择氮源也会决定后期pH值的走向。角毛藻的氮源比较时发现碳酸氢铵较好，生物量及细胞密度都较好。油脂的积累也是最好的。pH值变化也较小。碳铵被利用后要补充二氧化碳。补的氮源是氨水。

硅藻具有硅酸盐的壳，分裂时硅壳分为两部分。所以在合成硅壳的过程中一定形成硅，用量不能太少，并不是所以的硅藻都需要大量的硅酸盐在培养基中。有研究表明：三角褐指藻的繁殖过程中不需要太多的硅，有的硅藻硅壳较厚，花纹较多，这时需要大量的硅。

本文来自于范老师大讲堂直播间课程，范老师学生整理，讲课老师是华南理工大学魏东教授，借此机会机会感谢教授的辛勤付出。

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