净水技术|空气阴极微生物燃料电池可提高能量输出效率
小编导读
本文原标题为《不同分隔物对空气阴极微生物燃料电池阳极微生物菌群结构影响评价》，发表在《净水技术》第五期，入选“高校优秀论文奖学金暨研发机构人才储备计划”。
本期作者：邵伟
同济大学环境科学与工程学院
研究方向:膜生物反应器技术及污水处理
指导老师：王巧英
微生物燃料电池 (Microbial fuel cells，MFCs) 是一种可以将有机物中化学能直接转化为电能的装置。因其具有反应条件温和、设备构造简单、对污染物降解效率高等优点，近年来MFCs受到了国内外研究人员的广泛关注。而空气阴极MFCs则是MFCs的重要技术衍生，其利用空气中的氧气作为最终电子受体，不仅避免了传统MFCs在运行过程中需要不断补充电子受体的技术难题，还可以通过阴极与分隔物的耦合省去阴极室，减少反应器的占地面积、降低系统的内阻、并提升系统能量输出效率。
目前的研究结果表明，在空气阴极MFCs中，阴阳极分隔物的选择对系统产电性能有重要影响。质子交换膜 (例如，Nafion 117) 具有良好的质子选择性，且化学稳定性强，但昂贵的成本限制了其规模化应用；多孔结构的微滤膜、超滤膜成本低廉，电阻低，但这些分隔膜的氧传质系数一般较大，孔径选择不当会导致空气阴极MFCs库伦效率 (Coulombic efficiency，CE) 与能量效率降低。Zhang等人报道当多孔尼龙分隔膜的孔径从0.2 μm增加至160 μm时， MFCs的CE从36~76%降低至18~38%。在空气阴极MFCs长期运行过程中，不同性质的分隔物也会对阴极及阴极催化剂性能产生深远影响。如果阳极液中阴阳离子在分隔物中的扩散系数较大，会因i) 水分蒸发或ii) 化学键合而沉积到阴极催化剂表面，从而堵塞氧传质通路、降低氧还原反应速率。同时，MFCs阳极上胞外产电及其互养微生物大多为严格厌氧微生物，不同性质的分隔物 (例如，氧传质系数不同)也会对这些微生物种群结构产生深远影响，并最终影响系统的能量转化效率。然而，目前却鲜有此方面的研究报道。
本文将利用高通量454焦磷酸测序方法，对采用不同材质的阴阳极分隔物对空气阴极MFCs中阳极表面微生物多样性及种群结构变化的影响进行系统分析，并对主要操作分类单元(Operational taxonomic units，OTUs)进行系统发育学分析。本文的研究结果以期为空气阴极MFCs分隔物的选择提供重要科学依据。
本研究所用两套单室、空气阴极MFCs采用有机玻璃制成，尺寸为5 × 5 × 5 cm3 (空床有效容积为104 mL)。MFC装置示意图如图1所示。阴极为直径3 cm HCP 030N-125型圆形碳纸 (上海何森)，催化剂Pt 载量为0.5 mg·cm-2。为减缓水分蒸发，在阴极空气侧增涂双层聚四氟乙烯 (PTFE) 防水层。MFC阳极采用1 cm厚碳毡 (不防水，孔隙率≈ 90 %，比电阻率0.18 ~ 0.22 Ω cm) 制成，与阴极相对，置于反应器内侧。阴、阳极分别与钛丝、石墨柱 (直径6 mm，上海南球碳素) 相连后，接入外电路 (外电阻Rex = 100 Ω)。电极材料使用之前，先后经1 mol/L HCl与1 mol/L NaOH浸泡48 h并用去离子水清洗，以去除可能存在的金属与生物污染。
两套空气阴极MFCs (分别命名为R1与R2) 采用不同分隔物，其中R1采用Nafion 117质子交换膜，Nafion 117利用热压工艺直接与阴极相连。R2则采用孔径0.1 μm聚醚砜 (PES) 微滤膜。两种膜材质的电阻率为14.5 ± 0.4与8.4 ± 0.1 Ω cm2，氧传质系数为0.25与1.49 cm2 s-1。
在试验正式开始前，两套MFCs的阳极均接种了10 mL污泥混合液 (下文称该污泥混合液样品为S0)。所有试验均在30 ± 1°C条件下进行，每个运行周期为96 h。MFCs极室内使用的模拟污水 (即阳极基质) 成分如文献所示[5]，起始化学需氧量 (COD) = 640 mg/L。每次更换阳极基质前，均使用氮气对其进行脱氧10 min。
两套MFCs电路中外电阻两端电压E采用瑞博华 (型号：RBH8251) 数据采集卡进行记录，记录频率为60 min/次。电路中电流I采用欧姆定律进行计算，I = E/Rex。
运行10个周期后，从R1与R2阳极表面刮取一定量生物质 (S1与S2)，然后利用E.Z.N.A.®泥土样本DNA提取试剂盒 (Omega Bio-Tek公司，美国) 抽提DNA，并采用2.0% (质量/体积) 的琼脂糖电泳法对抽提的DNA质量进行检验。
PCR扩增：本文采用引物组27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'与533R：5'-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3'对S0，S1与S2的16S rRNA中V1~V3片段进行扩增。用于V1~V3片段的PCR反应的溶液体积为20 μL，包含4 μL 5 × FastPfu缓冲液、2 μL 2.5 mM的脱氧核糖核苷三磷酸混合液 (dNTPs)，0.4 μL 两种引物 (浓度均为5 μM)，10 ng DNA模板以及0.4 μL FastPfu聚合酶 (型号：TransGen AP221-02，中国北京)。PCR扩增采用GeneAmp® 9700 PCR仪 (Perkin-Elmer生物仪器公司，美国)，按如下条件进行：95 ºC、变性2 min后，95 ºC、变性30 s，退火至55 ºC、维持30 s，72 ºC，延长30 s，重复该PCR循环25次，并最终在72 ºC延长5 min。每个样品均重复3次，并将3次反应所得扩增产物融合，用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 (Tris_HCl) 纯化。最终PCR产物利用琼脂糖凝胶糖电泳检测，并用分光光度法进行定量。
焦磷酸测序与序列质量控制：本论文采用高通量测序平台454 GS FLX Titanium对扩增产物进行焦磷酸测序 (上海美吉生物医药科技有限公司，中国)。测序结束后，采用Qiime (版本1.17，http://qiime.org/) 对测序结果进行与处理，包括1) 对测序端正向引物进行错配检查，保留引物错配数在2个以内的序列；2) 检查序列3’端引物和接头，最大错配数设定为3，能够检测到反向引物和接头时，从检测位置截取前段序列；3) 设置50 bp长的碱基质量检测窗口，按照1 bp步长移动窗口。当窗口内平均质量低于20时，从该处位置截取前段序列；4) 去除模糊碱基数>0、单碱基高重复区>6 (或10)以及长度< 200 bp (或<150 bp) 的序列。对优化结果进行统计，然后将测序接头及引物序列从优化序列中去除
微生物分类学分析：利用UPARSE处理路径 (版本7.1，http://drive5.com/uparse/) 将优化序列聚类为OTUs。α多样性计算方法：对优化序列采用随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建稀释性曲线；Chao丰度指数(http://www.mothur. org/wiki/Chao) 及Shannon多样性指数 (http://www.mothur.org/wiki/Shannon) 通过MOTHUR软件进行计算。为得到每个OTU 对应的物种分类信息，采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU 代表序列进行分类学分析，并在各个水平 (门phylum，纲class，目order，科family，属genus) 上统计每个样品的群落组成。
图2给出了R1与R2在运行的第5周期 (384~480 h) 及第10周期 (864~960 h) 内的输出电压变化情况。在第5周期内，更换基质后，R2的启动输出电压达到~160 mV，而R1的启动输出电压仅为~85 mV；在第10周期内，更换基质后，R2的启动输出电压略有下降，为~130 mV，R1的启动输出电压为~85 mV。因此可以得出，使用PES微滤膜的R2输出电压高于使用Nafion 117质子交换膜的R1输出电压。由于反应器构型与使用的基质完全相同，R1与R2产电性能的差异应主要归因于两者内阻不同。其中，Nafion 117质子交换膜的电阻率为14.5 ± 0.4 Ω cm2，显著高于PES的电阻率 (8.4 ± 0.1 Ω cm2)。由于R2内阻低，产电性能好，导致在第5周期运行末期阳极基质耗尽，因此输出电压降低；而R1反应器内仍有有机基质，因此输出电压没有降低。
图2 R1与R2在两个运行周期内输出电压变化情况
利用高通量454焦磷酸测序手段对接种污泥样品，以及R1与R2运行10个周期之后阳极表面生物膜（分别标记为S0，S1和S2）中微生物16S rRNA基因文库进行测序。三个样品经降噪后各获得8020 (SD：2146) 条优化序列，平均读长为430 bp。使用UPARSE方法对OTU进行聚类分析，并得到相似度97%条件下的稀释性曲线 (如图3所示)。从图3中可以看出，三个样品呈现出不同的微生物丰度与多样性。接种样品S0的微生物多样性最高，Shannon指数为4.60，而S1中微生物群落的多样性最低，Shannon指数为2.44。按Chao丰度指数估算，S0、S1和S2中微生物OTUs数量分别为377，219和410。Eiler等研究结果表明，当微生物从复杂基质环境过度到单一基质环境中，部分微生物会在代谢竞争中被淘汰，该生物系统的结构单一性增强。相比于接种样品S0 (一套长期处理生活污水的MFCs阳极液)，空气阴极MFCs中阳极微生物在运行过程中以单一有机质 (乙酸钠) 为代谢底物，因此其微生物群落多样性有所降低。同时，S2样品的α多样性指数显著高于S1样品的α多样性指数，这可能是由于R2中PES膜的透氧率较高，会导致阳极表面存在一定兼性厌氧微生物。因此，下文将对S1与S2中微生物分类学及主要微生物系统发育学进行系统分析研究。
图3 S0~S2三个样品的稀释性曲线
图4总结了S0~S2样品中微生物在主要细菌门水平上的分布差异。通过焦磷酸测序，从3个样品中共检测出35个细菌门，其中相对丰度高于1%的包括变形菌门 (Proteobacteria)，拟杆菌门 (Bacteroidetes)，绿弯菌门 (Chloroflexi)，厚壁菌门 (Firmicutes)，绿菌门 (Chlorobi)，放线菌门 (Actinobacteria) 等。而变形菌门 (Proteobacteria) 是相对丰度最高的细菌门，分别占到S0，S1与S2样品中微生物总数的41.1%，88.3%与74.3%。在S0样品中相对丰度较高的拟杆菌门 (Bacteroidetes)，绿弯菌门 (Chloroflexi) 及螺旋菌门 (Spirochaetae) 在S1与S2样品中相对丰度均有不同程度降低。通过在细菌门水平上对3个样品的微生物群落结构的分析可以看出，S1与S2在单一门 (Proteobacteria) 中的相对丰度得到了显著增加，微生物多样性降低，这也与α多样性指数分析结果一致，表明在空气阴极MFCs处理污水过程中，阳极表面微生物结构发生了明显的变化，而且该变化还与分隔物的性质密切相关。因此，我们进一步对S1与S2两个样品细菌属水平上物种分布进行分析研究。
图4 S0~S2中微生物在主要细菌门 (相对丰度>1%) 水平上的分布差异。其中，Others表示相对丰度低于1%的其他物种
图5给出了S1与S2在微生物属水平上的分布趋势，其中S1中仅有6种细菌属的相对丰度>1%，而S2中有11中细菌属的相对丰度>1%，这进一步说明在S1中，由于底物来源单一 (乙酸钠)，经长期驯化后，某几种占支配地位的微生物的丰度得到了提升。经分类学分析，在S1中最显著的微生物为属于除硫单胞菌目 (Desulfuromonadales) 的AKYG597_norank，占到所有微生物总数的77.4%，应是主要产电微生物，这一微生物在S2中的比例为4.2% (表1所示)。此外，属于拟杆菌门 (Bacteroidetes)的vadinHA17_norank与丙酸杆菌科的Propionicicella在S1中相对丰度也较高，分别为3.6%与1.6%。相比而言，S2中丰度最高的微生物为地杆菌属 (Geobacter)，占到S2整体的36.4%，该微生物在S1中的比例仅为1.9%。
图5 S1~S2中微生物在细菌属水平上的分布趋势对比
目前致力于微生物产电细菌研究的学者普遍认为，地杆菌 (Geobacter) 是一种明显有产电活性的细菌，而AKYG597一度被认为是一种不具有产电活性的细菌，尽管最近有研究表明AKYG597可能也是一种具有产电活性的细菌。在S2中，其他丰度高的细菌包括根瘤菌 (Rhizobium)，黄色杆菌 (Xanthobacter)，磁螺菌 (Magnetospirillum)，不动杆菌 (Acinetobacter)，Paludibacter及BD1-5_norank (表1)。这些细菌也见于一些利用复杂底物的MFCs的阳极生物膜微生物群落中，而且部分微生物为需氧、兼性厌氧细菌。从本文的研究结果可以看出，使用多孔、透氧系数高的微滤分隔物会改变空气阴极MFCs阳极表面微生物种群结构，增加需氧、兼性厌氧细菌的比例，但这并不会导致产电微生物失去竞争优势，在S2样品中丰度最高的细菌仍是一种具有产电活性的Geobacter。同时，由于系统内阻降低，R2产生了更高的功率输出。
本文利用焦磷酸测序手段研究了利用Nafion 117质子交换膜与PES微滤膜的空气阴极MFCs长期运行后阳极表面生物膜的微生物群落结构差异。研究结果表明，焦磷酸测序可以全面揭示阳极生物膜的微生物多样性信息，例如在细菌门水平上共有35个门被检出，包括变形菌门 (Proteobacteria)，拟杆菌门 (Bacteroidetes)，绿弯菌门 (Chloroflexi)，厚壁菌门 (Firmicutes)，绿菌门 (Chlorobi) 等。相比于接种污泥，以乙酸钠为底物的阳极表面微生物群落结构多样性降低。其中，S1中相对丰度最高的细菌属AKYG597_norank占到了整体物种的77.4%，而S2中相对丰度最高的地杆菌属 (Geobacter) 的相对丰度也达36.4%。尽管利用PES微滤膜做分隔物的MFC氧扩散率增加，导致在阳极生物膜中根瘤菌 (Rhizobium)，黄色杆菌 (Xanthobacter) 及不动杆菌 (Acinetobacter) 等需氧、兼性厌氧细菌丰度得到了提升，但并没有影响到具有产电活性的细菌 (例如Geobacter) 占有生物学支配地位；同时，由于PES微滤膜的电阻率更低，使这套空气阴极MFC获得了更高的能量输出。
专家点评
微生物燃料电池利用微生物将化学能转化为电能，是污水处理领域近年研究的热点之一。论文研究了不同分隔物对空气阴极微生物燃料电池阳极微生物菌群结构影响，利用高通量454焦磷酸测序手段，研究了分别以Nafion117质子交换膜与聚醚砜（PES）微滤膜为分隔物的空气阴极MFCs长期运行时阳极表面生物膜的微生物群落结构差异。试验方法合理、数据翔实、理论分析正确。选题具有理论和使用价值，研究成果为优化微生物燃料电池阳极微生物菌群结构，提高MFC的能量产出提供参考价值。
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