新思路！10个样本的自测数据如何发6分+？
Somatic mutations and copy number variations in breast cancers with heterogeneous HER2 amplificationHER2异质性扩增乳腺癌的体细胞突变和拷贝数变异
一、文章背景
癌症是由一系列体细胞基因突变积累推动癌细胞增殖所导致的遗传性疾病。浸润性乳腺癌是含有多种分子亚型的异质性癌症。约12-20%的浸润性乳腺癌出现HER2基因扩增，通常导致HER2蛋白过表达。接受辅助化疗和/或局部放疗的浸润性乳腺癌淋巴结阴性/阳性患者中，HER2扩增与无病生存率和总体生存率的降低相关。随着人源化单克隆抗HER2抗体trastuzumab(Herceptin)的出现，抗HER2治疗药物得到了极大的发展。
无论是原位癌还是浸润性癌，大多数HER2阳性乳腺癌都表现出同质性HER2过表达和扩增，意味着其是推动癌细胞增殖的关键分子。然而，肿瘤内HER2异质性扩增的模式并不少见，5-41%的HER2阳性乳腺癌存在异质性。对异质性的观察结果表明，在一些肿瘤中，并非所有癌细胞都依赖HER2癌基因，其他基因异常可能成为HER2阴性亚克隆中癌细胞增殖和侵袭的有效替代驱动因子，如先前研究发现的BRF2和DSN1基因扩增以及HER2 p.I767M体细胞突变。
二、分析流程
三、结果解读
1.患者样本
作者分析了10例HER2空间异质性扩增的乳腺癌样本，其中8例为非特殊类型的浸润性癌(NST)及相关导管原位癌(DCIS)，1例为浸润性小叶癌及相关的小叶原位癌(LCIS)，1例为梭形细胞型化生性癌及相关DCIS。详细信息见表1。在一些患者中，HER2异质性扩增也与异质性激素受体状态相关。作者对所有患者都进行了淋巴结分期，6例患者未发现前哨淋巴结转移，患者10出现7个腋窝淋巴结宏转移，为靶向第二代测序(NGS)提供了充分的组织样本。患者4、9和5分别出现前哨淋巴结孤立肿瘤细胞转移、微转移和宏转移。由于可利用的肿瘤组织数量不足，作者并没有分析这些转移。
前哨淋巴结肿瘤细胞转移分为三种：①孤立肿瘤细胞（ITC）---淋巴结中肿瘤细胞团最大直径≤0.2mm。②微转移---肿瘤转移灶最大直径＞0.2mm但≤2mm。③宏转移---肿瘤转移灶最大直径＞2mm。
表1.患者和肿瘤特征的详细信息
2.覆盖分析和突变分析
作者从所有组织（除两个显微切割组织样本）中提取足够的DNA，用含有53个基因的panel靶向NGS分析。在ARID1B, BRCA2, CCND3, CHECK2, ERBB2, ERBB3, MAP2K4, MLL, NCOR1, NOTCH1, PBRM1和PDGFRA中未发现致病或可能致病的体细胞突变，也没有观察到致病的生殖细胞突变。基于四种预测工具和COSMIC数据库，作者在26个不同基因中鉴定到63个致病或可能致病的突变。如图1所示，这些突变包括12种缺失，9种插入，32种错义突变，7种无义突变（引入终止密码子）和3种剪接位点改变。且这些体细胞突变在ARID1A、MLL3、NF1、PIK3CA和TP53中常见。
图1.26个基因致病或可能致病的突变
靶向NGS分析发现了每个肿瘤成分体细胞突变全景中存在的潜在异质性。有些突变同质性分布于每个肿瘤成分，如PIK3CA突变的7个肿瘤中有4个肿瘤是同质性突变的；有些突变异质性分布，如体细胞TP53突变，且与HER2的扩增状态无关。（表2）
70%（7/10）的乳腺癌中肿瘤抑制基因TP53至少发生一种突变，包括5种错义变异、3种缺失突变和1种剪接位点改变。其中，TP53在4、5和8号患者所有肿瘤成分中同质性突变，在1、2、7和10号患者都出现一个TP53异质性突变的肿瘤。如1号患者HER2-DCIS成分和HER2+浸润性成分中出现p.R248W TP53突变，HER2+DCIS组分出现p.Y234H TP53突变。
70%（7/10）的乳腺癌中含一种PIK3CA突变。患者1、4、5、7和9号每个肿瘤成分均存在同质性PIK3CA突变，而患者3和6号的乳腺癌中PIK3CA呈异质性突变分布。如3号患者HER2-浸润性成分中出现p.G1049R错义突变，DCIS成分中未检测到，无论其HER2状态如何。
单个肿瘤中HER2-/+成分的遗传异质性表明，大量不同的体细胞突变和/或CNVs可能是潜在的替代驱动因子。这些突变可能会抵消HER2-成分中HER2扩增的缺失。
表2.患者肿瘤成分中常见突变基因的体细胞突变
作者还发现，其他不太常见的基因（AKAP9，ATM，BRCA1，CBFB，CDH1，EGFR，ESR1，FBXW7，GATA3，MAP3K1，MED12，MLL2，MLLT4，NFATC2，PTEN，RB1，RNF213，RUNX1，SF3B1，SPEN和TBX3）的体细胞突变通常在肿瘤中异质性表达，且似乎与HER2扩增状态无关，除了GATA3突变。体细胞GATA3突变发生在HER2+肿瘤成分：患者2的HER2+原位成分和浸润性成分中出现GATA3突变，而在HER2-浸润性成分中未出现。患者3的HER2+LCIS成分中出现GATA3剪接位点突变，而在HER2-原位和侵袭性成分中未观察到。
3.拷贝数变异分析
作者接下来研究了高水平的拷贝数变异CNVs（图2-3），证实所有HER2+癌成分中均出现HER2扩增，并将其作为内部质控。结果表明，患者1的HER2-DCIS成分中EGFR拷贝数增加，患者3的HER2-浸润性小叶癌出现FGFR1扩增，而在HER2-/+的LCIS成分中不出现这种扩增，患者5的所有肿瘤成分都出现FGFR1拷贝数增加。
分析发现，患者9和10的HER2-肿瘤成分均出现8q24扩增，包括MYC和邻近lncRNA PVT1拷贝数增加。已有研究将共扩增的MYC和PVT1基因鉴定为ER2+HER2+乳腺癌的候选癌基因。且PVT1高表达与不良预后的临床病理标志有关，如更大的肿瘤体积、更高的TNM分期、淋巴结转移和远处转移。体外研究也表明，PVT1表达通过促进KLF5/BAP1/beta-catenin信号通路促进癌细胞增殖。
患者9的HER2-肿瘤成分中还出现CCND1拷贝数增加。在ER-HER2-淋巴结阴性的乳腺癌患者中，CCND1扩增与特定的基因表达谱和生存率降低有关，表明CCND1扩增也可能是癌变的一种替代驱动因子。乳腺癌和其他类型癌症中的FGFR1扩增也有类似的报道。
图2.患者1的异质性拷贝数变异和异质性HER2、EGFR表达
图3.乳腺癌患者3的异质性HER2过表达和拷贝数变异
4.补充免疫组化分析
作者对所有肿瘤组织样本进行EGFR免疫组化分析（图4）：患者1中，HER2-DCIS成分中的EGFR扩增与EGFR蛋白过表达有关，其他肿瘤中未发现EGFR蛋白过表达。而3号和5号患者的肿瘤组织样本中免疫组化分析结果显示，FGFR1在两种肿瘤成分均不出现明显阳性(数据未显示)。
图4.患者1中HER2、EGFR的异质性表达
小结
HER2异质性乳腺癌的HER2阴性成分在53个乳腺癌相关基因中出现多种体细胞突变和CNVs。虽然这些体细胞突变和CNVs也经常出现在HER2阳性成分中，但它们可能作为潜在的替代驱动因子来弥补HER2扩增的缺失。因此在靶向HER2治疗中，这些替代驱动因子可能绕过了HER2通路阻断，为HER2异质性乳腺癌对HER2靶向治疗的高耐药性提供了一种可能的解释。此外，作者的研究结果间接表明，从长期来看，单药靶向治疗不太可能取得很高的疗效，因为它会导致细胞毒性损伤，且存在对含有致癌替代驱动因子的耐药克隆的选择性。未来的转化乳腺癌研究应该关注如何在临床环境中处理这种分子异质性。
此外，文章也存在一些不足之处：①本篇文章中靶向NGS的研究只关注了10名乳腺癌患者中的53个乳腺癌相关基因。由于作者没有在更大的患者群众进行全基因组测序，因此不能排除HER2-肿瘤成分中存在更常见的替代驱动因子。尽管如此，作者的发现与TCGA的观察结果一致，该结果描述了75例临床her2阳性乳腺癌中TP53(55%)和PIK3CA(31%)的高频突变以及RUNX1(1%)、PTEN(0%)、NCOR(0%)和CDH1(3%)的低频突变；ER-HER2+乳腺癌中TP53高频突变，以及ER+HER2+乳腺癌更常出现GATA3突变。可能是由于样本量太小，作者并未研究这种激素受体依赖的二重性。②由于基因panel的局限，文章并未挖掘到单个肿瘤中所有成分间的直接克隆关系。