原创解读|SNP芯片在长穗偃麦草渐渗系筛选中的应用
2020年4月20日，TAG在线发表了题为“Exploiting the genome of Thinopyrum elongatum to expand the gene pool of hexaploid wheat”的研究论文。
【背景】六倍体小麦是重要的粮食作物，每日为全球提供的膳食热量占到了约20%。由于其单源进化或二源进化机制以及随后的驯化，小麦已经历过一次重大的遗传瓶颈。近几个世纪，农业所施加的密集选择压力侵蚀了小麦基因库的变异，极大地降低了育种中可用遗传资源的多样性。新出现的病害和多变的气候进一步影响着小麦的产量，威胁着世界范围内的粮食安全。增加小麦可利用的遗传变异，进而培育优良的栽培品种就显得至关重要。通过种间杂交将小麦野生近缘物种所携带的优异基因转移到普通小麦是解决此问题的有效途径。
长穗偃麦草（Thinopyrum elongatum）属于小麦三级基因库，其染色体组包含多种倍性，目前已鉴定的有二倍体（2n=2x=14，EE）、四倍体、六倍体和十倍体。作为偃麦草属植物中的重要成员，长穗偃麦草与小麦遗传关系较近，且携带有大量和农艺性状相关的优良遗传资源，如耐盐、耐涝、多年生习性、抗病和改良面粉品质等，是适合拓宽小麦基因库的候选物种。
【主要结果】首先，作者将十倍体长穗偃麦草401007（2n=10x=70（ 4））与中国春ph1/ph1突变体杂交，所得F1代种子与另一普通小麦Paragon（Ph1/Ph1）回交获得BC1群体，再将BC1代种子与Paragon连续回交四代得到BC2、BC3、BC4和BC5群体，同时这四个回交群体也被用于产生自交群体（图1）。并统计了各世代种子的萌发和育性情况（表1）。
图1 十倍体长穗偃麦草401007与小麦的杂交过程，以及各代种子数据统计
表1 长穗偃麦草X小麦各世代种子数据统计
其次，利用小麦35K SNP芯片对17个中国春-长穗偃麦草附加系（源于约翰英纳斯中心）和本次杂交的三个亲本（各三个重复）以及从BC1-BC5五个群体中选取 的330个植株进行基因型分析，发现1594个标记在小麦和长穗偃麦草之间显示出多态性。通过Flapjack™分析剔除497个错误标记，并移除834个单分离或分离不一致的标记。最后使用JoinMap® 4.0将剩余的263个标记定位到7个连锁群，构建长穗偃麦草遗传连锁图谱（图2）。定位到1连锁群的标记最多，有68个（26%）；而定位到5连锁群的标记最少，只有19个（7%）。基于此连锁图谱，作者从回交群体中共筛选到134个小麦-长穗偃麦草渐渗系。
图2 263个Afymetrix SNP标记在长穗偃麦草七个连锁群上的分布
最后，对通过SNP芯片筛选到的小麦-长穗偃麦草渐渗系进行sc-GISH分析，进一步证明这些长穗偃麦草特异SNP的有效性，能够体现渗入外源染色体的数目和片段大小，适合追踪渗入到小麦中的长穗偃麦草染色质，如筛选到的BC5-26A植株携带了5E染色体片段（图3）。此外，作者还通过mc-GISH检测了长穗偃麦草与小麦三个基因组的重组事件，发现E-A重组事件13个，E-B重组事件11个，E-D重组事件5个，且这些重组发生的位置并不局限于染色体远端（图4）。
图3 SNP标记筛选长穗偃麦草渐渗系示例与sc-GISH分析验证
红色：长穗偃麦草染色质；蓝色：小麦染色质
图4 E基因组与A、B、D基因组之间的重组事件
黄色：E基因组；绿色：A基因组；蓝色：B基因组；红色：D基因组
【部分讨论点】1. GISH分析十倍体长穗偃麦草：其基因组至少包含两个不同的基因组，例如百萨偃麦草和拟鹅观草，且两个基因组之间存在大量的重组（图5）。所以十倍体长穗偃麦草的基因组组成为EEEEEEEstEstEstEst或JJJJJJJstJstJstJst，这种组成也出现在彭提卡偃麦草，从而说明十倍体长穗偃麦草401007与彭提卡偃麦草遗传关系近。
图5 mc-GISH分析十倍体长穗偃麦草401007
绿色：百萨偃麦草基因组DNA 红色：拟鹅观草基因组DNA
分析杂交F1代种子的萌发率与可育率：十倍体长穗偃麦草与小麦杂交F1种子萌发率为57%，显著高于其他近缘物种，如Amblyopyrum muticum（28.6%）和 Aegilops speltoides（15%）（King et al. 2017，2018）。其杂交F1代种子可育率高达88%，而其他近缘物种杂交F1种子的可育率普遍较低，如Th. Bessarabicum（1.6%），Am. Muticum（16%），T. urartu（21%）和 Ae. Speltoides（29%）（Grewal et al. 2018a，b；King et al. 2017，2018）。这种差异可能由以下两种原因造成，一是这些近缘物种基本都是二倍体，杂交时许多染色体在减数分裂时期配对失败，产生了大量的不平衡配子。二是长穗偃麦草的E和Est基因组与小麦的D基因组关系较近，维持了减数分裂时期的染色体配对水平，减少了不平衡配子的产生。这也能解释为什么小麦和长穗偃麦草杂交F1代表现出雄性可育，而刚才所提及的其它近缘物种与小麦杂交F1代均显示雄性不育。另一值得注意的现象，小麦X长穗偃麦草BC1代种子的可育性降低到了56%。
此次研究中，仅筛选到263个长穗偃麦草特异的SNP标记，这是因为在筛选异源多倍体物种和小麦之间多态性SNP时，要求多倍体物种每个基因组在该位点与小麦三个基因组展示相同的多态性，从而造成大量的SNP标记被移除。这样就会导致部分基因组区域因为缺乏相应的特异SNP标记而无法被检测，所以利用SNP芯片筛选多倍体渐渗系材料需要提高构建图谱的精度和密度。
E基因组与小麦三个基因之间的共线性分析：通过SNP标记比对，E基因组与小麦D基因组展示最大的匹配度94.5%，而与A基因组和B基因组的匹配度分别为89.4%和92.4%。然而检测到E-D之间的重组却最少，只有5个，可能是由于mc-GISH分析的材料较少造成的。
重组位点不局限于染色体远端：在小麦中，重组通常发生在染色体远端，而在此次小麦和长穗偃麦草杂交后代中，观察到染色体重组在染色体远端和近端均有发生，这就使得我们有机会研究和开发染色体近端区域所携带的优异等位基因。
在此次研究中，作者基于35K SNP芯片筛选出263个长穗偃麦草特异的SNP标记并构建了遗传连锁图谱。然后利用这些SNP标记分析十倍体长穗偃麦草和小麦杂交、多代回交、自交群体，从中获得了134个小麦-长穗偃麦草渐渗系，并通过GISH分析进行了验证。其实，近几年诺丁汉大学的King lP课题组联合布里斯托大学生物科学学院一直致力于小麦近缘物种特异SNP位点的研究，构建相应的遗传连锁图谱，并将其用于小麦-外源渐渗系的筛选，获得了大量含外源染色质的材料。下一步工作的重心将会是研究这些渐渗系材料的农艺性状，开发导入小麦背景中的优异基因资源，并将其用于小麦育种。
以下四篇文章展示了SNP芯片在小麦其它四个近缘物种中的应用
Amblyopyrum muticum特异SNP标记遗传连锁图谱
拟斯卑尔脱山羊草特异SNP标记遗传连锁图谱
百萨偃麦草特异SNP标记连锁遗传图谱
乌拉尔图小麦特异SNP标记遗传连锁图谱
SNP芯片数据库可参考：https://www.cerealsdb.uk.net/cerealgenomics/CerealsDB/indexNEW.php
参考文献
Grewal S, Yang C, Edwards S, Scolefeld D, Ashling S, Burridge AJ, King IP, King J (2018a) Characterisation of Thinopyrum bessarabicum chromosomes through genome-wide introgressions into wheat. Theor Appl Genet 131:389–406.
Grewal S, Hubbart-Edwards S, Yang C, Scholefeld D, Ashling S, Burridge A, Wilkinson PA, King IP, King J (2018b) Detection of T. urartu introgressions in wheat and development of a panel of interspecifc introgression lines. Front Plant Sci 9:1565.
King J, Grewal S, Yang CY, Hubbart-Edwards S, Scholefeld D, Ashling S, Edwards KJ, Allen AM, Burridge A, Bloor C, Davassi A, da Silva GJ, Chalmers K, King IP (2017) A step change in the transfer of interspecifc variation into wheat from Amblyopyrum muticum. Plant Biotechnol J 15:217–226.
King J, Grewal S, Yang CY, Hubbart-Edwards S, Scholefeld D, Ashling S, Harper JA, Allen AM, Edwards KJ, Burridge AJ, King IP (2018) Introgression of Aegilops speltoides segments in Triticum aestivum and the efect of the gametocidal genes. Ann Bot 121:229–240.
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