QPCR步骤(1)
QPCR(枪头和离心管均无RNA酶)提取细胞RNA1. 细胞长满80%,弃培养基,冰PBS洗涤细胞2次空干(用枪吸尽PBS)2. 加1ml冰TRizoL(大皿1.5ml 中皿1ml 六孔板500ul),吹打使细胞完全脱落,吸入1.5ml EP管(无酶)3. 加氯仿200ul,漩涡混匀器振荡15秒,室温静置5分钟4. 4℃ 12000rpm 5分钟5. 吸取上层水相(勿吸入中间层)0.5-0.7ml移至另一1.5ml离心管中,加异丙醇0.5-0.7ml(1:1加入)6. 充分混匀,冰盒上静置10分钟, 4℃ 12000rpm 30分钟7. 弃上清,加75%冰乙醇(DEPC水)1ml, 颠倒混匀数次8. 4℃ 12000rpm 5分钟9. 弃上清, 吸干, 加DEPC处理去离子水10-20ul (视沉淀大小而定)10. 测浓度(取5ul作RNA电泳,5ul作RNA定量,余-80℃冰箱保存)RNA鉴定:在紫外分光光度仪上测定RNAOD260/OD280均在1.8~2.0之间,表明抽提RNA纯度良好。反转录反应:1.去除基因组DNA:(0047A)按下列组成配制反应混合液(冰上进行):试剂 加入量gDNA Eraser 1μl5×gDNA Eraser Buffer 2μl总RNA ≤1μgRNase Free 水 补足至10μl→离心→PCR仪(42℃ 2min 4℃ hold)2.反转录反应:(037)按下列组成配制反转录反应液(冰上进行):试剂 加入量PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4μlRT Primer Mix 1μlRNase Free 水 4μl→离心→PCR仪(42℃ 15min85℃ 5s 4℃ hold得到的cDNA于-20℃保存PCR反应:采用Real-time PCR技术分别检测各基因表达丰度。所有操作均在冰上完成,以β-actin为内参基因,引物均由上海生工设计并合成。每组设置3个复孔,不同标本的相对表达定量(RQ,Relative Quantity)值RQ=2-△CT。△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值。详细步骤如下:按下列组成配制PCR反应液:试剂 加入量TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) 5μlROX Reference Dye II(50×) 0.2μlPCR Forward Primer(10 μM) 0.4μlPCR Reverse Primer(10 μM) 0.4μlDNA 模板 1μlRNase Free 水 3μl使用ABI 7500 Real-Time PCR仪按以下条件进行PCR反应:95℃ 30sec 预变性 1cycle 95℃ 5sec 60℃ 34sec PCR反应 40cycles