siRNA转染的方法

A.siRNA转染的方法

哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。

应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面:转染试剂的用量、siRNA的用量、转染时的细胞密度、转染时的操作顺序、细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间

B.Lipofectamin2000 转染试剂

选择最适合的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作,可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染,也可应

用于DNA/siRNA的共转染操作;是一种新型的高效siRNA转染试剂。

Lipofectamin2000的应用领域:

1、原代培养细胞和转化细胞株的基因转染
2、siRNA高通量转染试验
3、DNA转染;DNA和siRNA的共转染
4、核酸(siRNA、DNA、RNA)的体内导入试验
5、贴壁细胞和悬浮细胞转染

Lipofectamin2000 的特点: 

1、不必更换培养基,操作简便易行,可在半小时内完成操作
2、在含血清培养基中也能表现高转染效率
3、细胞毒性低;适用细胞广泛
4、即用型试剂,可在含有抗生素的完全培养基中转染
5、基于脂质的转染试剂,确保没有RNAse活性
6、可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入

C. Lipofectamin2000适用的细胞类型

Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如:HeLa(人颈部癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。

D.转染前细胞培养

在细胞板上培养细胞时,应使细胞汇合在24小时内达到70-90%。

E.合适的lipofectamin2000用量

合适的siRNA(DNA):lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响;我们推荐的DNA:lipofetamin2000为1:0.5—1:5(ug:ul),siRNA:lipofectamin2000为1:0.01-1:0.1(pmol:ul)一般情况下,此范围内都可获得高的转染效率。

F.贴壁细胞转染程序

选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。

1、转染前一天,4-5´104细胞接种在24孔板上, 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM(或Opti-MEM,其他培养基)细胞培养基。
2、选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
3、在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀;
4、混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μllipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;

5、将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。
6、将100μl siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板板。
7、 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。

G.悬浮细胞转染程序

1、转染的当天,收集细胞离心,用含FBS的培养基重悬。
2、在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀;
3、混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染时,则加入2μl lipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;
4、将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。
5、再加入400μL细胞悬浮液(细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间)。
6、细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。

H.DNA和siRNA共转染细胞

1、在转染的前一天,4-5´104细胞接种在24孔板上,0.5 mL含FBS和抗生素的细胞培养基。
2、选择用于初期接种的细胞密度,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
3、在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg DNA,加入2μl lipofectamin试剂,充分混合,放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin复合物。
4、将siRNA/ DNA/lipofectamin复合物加入培养基中,轻轻混匀。
5、细胞在37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它步骤。

I.siRNA体内导入方法

1、适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中,轻轻混匀,因为注射液体积有限,建议采用高浓度的siRNA或DNA,一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。
2、取适量的DNA、siRNA或siRNA\DNA复合物与lipofectamin混合。例如,在1#管中加入0.5μL的DNA(1μg)和0.5μL的siRNA(5μg),在2#管中加入0.55μL的lipofectamin(24μg)和0.45μL不含RNA酶的无菌水中,将1#管中的溶液加入2#管中,在室温下温育30分钟,以形成siRNA/DNA-lipofectamin复合物。
3、制备的siRNA/DNA-lipofectamine复合物可用于体内导入siRNA、DNA或siRNA\DNA。

展开

(0)

相关推荐

  • 细胞转染实验注意事项有哪些?

    本实验室常用invitrogen的细胞转染试剂:Lipofectamine2000.转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,使其在转染日密度为90%.细胞铺板在0.5ml含血清,不含抗生素的正常生长 ...

  • 细胞转染实验具体方法

    细胞转染:HEK 293T细胞是慢病毒包装生产及滴度测定,细胞转染,条件培养基制作,蛋白表达验证等试验所必须的工具细胞.HEK 293T细胞为人胚肾细胞: 细胞转染的目的粗略理解为使用阳离子聚合物+质 ...

  • siRNA的合成方法与技巧

    siRNA合成的方法主要包括: 1.化学合成 2.体外转录 3.长片断dsRNA经RNaseIII类降解(如Dicer.E.coli.RNaseIII) 4.siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达 ...

  • 细胞株转染方法介绍

    通常使用的转染方法主要有DNA-磷酸钙共沉淀法,电击法,脂质体法. 质粒DNA的基本元件 外源基因是以质粒DNA的形式进入动物细胞的,同时质粒DNA上带有提高外源基因转录和翻译水平的元件.尽管病毒来源 ...

  • RNAi与小分子抑制剂的差异|siRNA|抑制剂|化合物|生物学|基因|方法|

    RNAi(左)和小分子抑制剂(右)抑制蛋白质活性的作用方式 如图所示,RNAi中常用的siRNA和shRNA都是针对蛋白质表达前的mRNA进行靶向,进而调控蛋白质表达量,而小分子抑制剂则是靶向蛋白质- ...

  • AAV-HBV转染小鼠模型构建方法

    2001年,Sprinzl等[29]开发了腺病毒载体携带1.3倍的鸭HBV基因组(Ad-DHBV),经尾静脉注射进入小鼠体内的方法.采用类似的方法,von Freyend等[30]将含有1.3倍HBV ...

  • 细胞转染方法有哪些?

    细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成,这对大分子物质来说是个不可透过的屏障,比如DNA和RNA的磷酸骨架,其也带负电荷.为了使核酸穿过细胞膜,研究人员开发了多种技术,大致分为三类:化学方法---利用载体分 ...

  • 一种利用外泌体递送siRNA至小鼠大脑的方法

    今天为大家推荐一个几年前的研究工作,没有给大家介绍过但是很重要.大家都知道,由于其生物相容性好等优点,外泌体这种天然的膜泡在药物尤其是大分子的递送方面具有很好的应用前景.但是天然外泌体的靶向性其实并不 ...

  • 细胞瞬时转染原理及实验方法步骤

    哺乳动物细胞瞬时转染能在短期内快速表达高活性蛋白而被广泛应用.本文主要介绍了细胞瞬时转染的步骤.原理,及血球计数板对细胞计数的原理和方法. 哺乳动物细胞自身具有蛋白折叠和翻译后修饰的功能,获得的蛋白更 ...

  • 肋间神经痛针灸治疗方法

    肋间神经痛 肋间神经痛系指一个或几个肋间部位沿肋间神经分布区发生经常性疼痛,并有发作性加剧特征.原发性者较少见,继发性者多与邻近器官和组织的感染.外伤或异物压迫等有关.此外,髓外肿瘤和带状疱疹亦常为产 ...