GUS组织化学染色
试剂：
GUS染色液（200ml）：
X-Gluc 100mg； 50mM k4[Fe(CN)6] 2 ml; 50 mM k3[Fe(CN)6] 2 ml；0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 4 ml; 甲醇 5ml；Triton X-100 0.2ml; 加入50mM 磷酸缓冲液（pH 7.0）补足200ml；无菌膜过滤。
X-Gluc：100mg溶于1ml DMF，保存于4℃
50 mM k3[Fe(CN)6]： 0.824g溶于50ml ddH2O，避光保存于4℃
50 mM k4[Fe(CN)6]： 1.056g溶于50ml ddH2O，避光保存于4℃
50mM 磷酸缓冲液（pH 7.0）：
先配:
0.2M Na2HPO4：称取71.632g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水中，
0.2 M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水中，
然后：
62ml的0.2M Na2HPO4与38ml的0.2 M NaH2PO4混合，加蒸馏水稀释至400ml。
二、实验步骤：
1. 取新鲜烟草叶片组织于90%丙酮中固定20 min；
2. 弃丙酮，加入适量GUS染色液（不含X-Gluc）润洗一遍；
3. 加入GUS染色液，真空处理20 min；
4. 37℃孵育24h；
5. 无水乙醇浸泡24h，除去叶绿素；
6. 观察结果并照相。
烟草叶片GUS活性的荧光定量测定
MrBAS基因启动子转基因烟草叶片组织器官的GUS活性定量分析以GUS蛋白荧光测定完成,
表2 GUS蛋白提取缓冲液
TabIe.2 GUS protein extraction buffer
组分 母液 体积
50 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0) 0.1 mol/L 磷酸缓冲液 (pH 7.0) 50 mL
10 mmol/L Na2-EDTA 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 2 mL
10 mmol/L β-巯基乙醇 β-巯基乙醇 100μl
0.1% TritonX-100 Triton X-100 100μl
0.1% SDS 10% SDS 1 mL
ddH20 补足 100 mL
烟草叶片总蛋白的提取
1) 取超低温冰箱保存的样品材料并用液氮充分研磨成粉末，分别称取1.2g样品组织于离心管中；
2) 向离心管中分别加入1mL GUS蛋白提取缓冲液，涡旋混匀，冰上放置2h至沉淀；
3) 4℃ 6000 r/min 离心 20min，收集上清液；
4) 滤纸过滤，去除植物组织残渣；
5)吸取200μl上清液，保存在4℃冰箱中待用 (考虑到GUS蛋白的活性,时间以一周内为宜)。
样品总蛋白浓度测定
采用考马斯亮蓝G-250染色法测定样品材料中总蛋白质含量(Bradford, 1976)。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，在波长488 nm处有最大光吸收值，当其与蛋白质结合后呈现蓝色，考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合在2min左右达到平衡，完成反应十分迅速，且二者的结合物在室温下1 h保持稳定，结合物在波长595 nm处有最大光吸收值，其吸光值与蛋白质含量成正相关性，因此通过测定波长595 nm处最大光吸收值，可以计算出实验样品中的总蛋白质含量。具体步骤如下；
1)制作BSA标准曲线：取配制好的100μg/mL BSA标准母液溶液，按表3制作不同浓度梯度的标准液。
表3不同浓度梯度BSA标准液
Table. 3 BSA standard samples
BSA 标准母液(mL) ddH20(μL) BSA 浓度(μg/mL)
0 1000 0
50 950 5
100 900 10
200 800 20
400 600 40
600 400 60
1000 0 100
分别取上述不同浓度梯度的BSA溶液200μL 至2 mL离心管中，添加1 mL考马斯亮蓝G-250溶液，涡旋振荡混匀，室温静置2min，分光光度计测定波长595 nm的吸光度值，吸光度值对应不同蛋白质浓度绘制标准曲线。
2)样品GUS提取液蛋白质含量测定:
2.1分别取5μL 样品GUS提取液到2mL离心管中,
2.2加入195μLddH2O，稀释40倍，
2.3向各个离心管中添加1 mL考马斯亮蓝G-250溶液，涡旋振荡混匀；室温静置2min，
2.4用分光光度计测定样品提取液在波长595 nm处的吸光度；
2.5根据BSA溶液标准曲线计算各个样品GUS提取液中蛋白质的含量。