“这个小东西很好玩，一口唾沫，指头按两下，就可以知道你是否感染结核，以及是什么类型，” 中秋节前，常凌乾发了一条朋友圈。
从北京到成都，大约两千公里。路途虽远，北京航空航天大学教授常凌乾，却用自己团队的科研技术，帮助华西医院度过了 2020 年疫情伊始的核酸检测难题。如今，双方再次携手，这次他们要帮助的对方是四川大凉山贫困地区的结核病人。在那里，结核病依然比较严重，且已成为一种致命疾病。经过一年多的研发和验证，常凌乾制造出一种低成本、便携式的微流控装置，并给其命名为 Fd-MC（finger-driven disposable micro-platform ）。它具有低成本、便携、手指驱动等优点，并搭载重组酶聚合酶核酸等温扩增技术，集核酸提取、扩 增、检测于一体，可对痰液样本中的结核杆菌实现便携现场快速检测。只需动动手指，就能在一个完全分离的微通道中，完成完整的结核病诊断过程。要想判断是否患有这种疾病，就得进行结核杆菌检测，这时就需要大型核酸检测设备。但是在乡村卫生院和基层诊所，往往没有这个条件。结核病，是由结核分枝杆菌引起的传染病，也是致死率最高的单传染病原体之一。据世界卫生组织统计，2019 年结核病导致 1000 多万新感染病例，140 万人死亡。因此，快速准确诊断疑似结核病携带者的方法，仍然是抑制其传播的关键。在四川当地，老百姓要做常规性结核病筛查，一般要到设备齐全的三级医院，只有那里才有商用核酸检测仪器。但这种仪器价格昂贵，对实验室和专业人员的要求都比较高，因此很难应用在偏远地区。此外，尽管商用核酸检测仪器已被证明具有临床可接受的特异性和敏感性。然而，这些系统的一个共同缺点是，它们的实验室环境需要在样品制备、核酸扩增和检测后，由熟练的操作人员在相对复杂的过程中操作。这两个因素都阻碍了它们在结核病死亡的偏远地区的使用。因此，迫切需要设计低成本、易于操作且准确的平台来弥合这一差距。在此之前，常凌乾一直和华西医院合作核酸检测项目。看到这一需求之后，常凌乾研发了上述这种既不需要电，也不需要额外设备，此外还得价格便宜、测试快速，总之一切都要以简单为主。
图 | 相关论文（来源：受访者）
日前，相关论文已由合作双方发在 Biosensors ＆Bioelectrnics（IF: 10.7）上，论文题为 《基于等温扩增的手指驱动一次性微平台在结核病多点诊断中的应用》（A finger-driven disposable micro-platform based on isothermal amplification for the application of multiplexed and point-of-care diagnosis of tuberculosis） 。第一作者是北航博士生王之莹，共同作者是北航王杨副教授，共同通讯作者分别是北航常凌乾教授、以及华西医院检验科主任应斌武教授。Fd-MC 大约有手掌那么大，长度 55mm、宽度 66mm、厚度 5mm，上面有一个直径 1.6mm 的样品注入孔，还有两个用于存储相应缓冲液的圆柱形腔，以及用于 DNA 提取的微通道。芯片基底采用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）进行激光刻蚀，并在缓冲液储存室的上表面覆盖弹性膜。当按压弹性膜时，可直接驱动液体在微流道中流动，从而可摆脱对电力、外部泵的依赖。此外，在芯片上设计了 “W” 形通道的 DNA 提取区，并在内部填充二氧化硅颗粒，基于二氧化硅对病原体的核酸进行固相萃取。当样品进入到微通道与硅粒子混合时，在高浓度的盐离子作用下，样品中带负电荷的 DNA 分子通过阳离子盐桥与硅粒子结合，从而被吸附于二氧化硅珠上。研究中，常凌乾采用基于 FAM 探针的原位荧光策略，通过手持式紫外灯，可用肉眼读取芯片的结果。因此在避免感染或环境污染的风险方面，Fd-MC 具有独特的优势。在检测区，常凌乾设计了 5 个平行的“y形”反应区 “y形” 反应区由 “y形” 通道和圆柱形腔室组成，每个 “y形” 腔室由一个小的通道连接。一旦液体进入检测区域，将首先填满 “y形” 通道，直到装置被轻微摇晃才会流入到装载有 RPA 反应物的圆柱形腔室。这种设计可以建立一个物理分区，允许每个室形成一个独立的环境，避免液体流动造成的交叉污染。该团队在多重检测中，针对人型结核分枝杆菌（MTB）、 结 核 分 枝 杆 菌 复 合 群（MTBC）、分枝杆菌（MB），分别设计 RPA 特异性引物。该芯片不仅能识别结核/非结核感染，还能区分人结核分枝杆菌/牛结核分枝杆菌。在操作时，把经过前处理的痰液或者咽拭子加到进样口，依次用手指按压两个弹性膜。然后，将芯片置于 37-42℃ 的温度，20 分钟之内即可实现核酸等温扩增。测试完之后，将芯片置于设计的小型读取设备中，并用手机 App 进行拍照，通过荧光显色，表明受测者是否患有结核，甚至还能检测结核的亚型。总的来说，Fd-MC 能够实现芯片上的 “样本输入和结果输出”，集成了包括从结核病病原体中提取 DNA、基于 RPA（重组酶聚合酶扩增）的荧光可视化的多个操作步骤。
图 | 基于核酸等温扩增的手指驱动式微流控芯片（Fd-MC）快速检测结核杆菌的原理示意图（来源：受访者）
Fd-MC 通过 37 个临床样本进行了验证，包括奇美拉分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，以及由中国四川大学华西医院提供的 20 份临床阳性痰样本，和健康志愿者们捐赠的 10 份健康痰样本。所有临床样本均经华西医院经伦理批准确认。验证结果表明，与商业实时荧光 RPA 相比，在对 37 个临床样本的检测中，Fd-MC 获得了 100% 的特异性（指正确检测阴性样本的能力)，敏感度(指正确检测阳性样本的能力）为 95.2%。
图 | Fd-MC 对临床结核病样本诊断的验证（来源：受访者）
