脑组织单细胞悬液制备流程 / 开普饭

脑组织背景介绍

人脑是指包容在颅腔内的三大块神经纤维组织：大脑、脑干和小脑。大脑占主要部分，大脑分左右两个半球，两半球间有横行的神经纤维相联系，大脑半球表层为皮质，皮质的深部由髓质或白质构成，髓质中又含神经纤维和基底核（灰质团块）。皮质占整个大脑半球的比例为40 %左右，主要由神经元的胞体和神经胶质细胞构成，神经元通过相互之间形成的突触彼此连接，形成复杂的神经网络和通路，大量紧密交织的神经元突起和神经胶质细胞突起组成神经毡或神经纤维网，包围在神经元胞体周围。

因此，在脑组织解离过程中，我们使用Worthington STEMxyme I和脱氧核糖核酸酶I，Worthington STEMxyme I为组织溶梭菌胶原酶和中性蛋白酶的特殊组合，胶原酶能够降解天然胶原和网状纤维，中性蛋白酶通常和胶原酶等结合作为次级酶，只能破坏细胞外基质而不破坏细胞之间的连接，因此主要用于细胞集落的分离和将组织块分解成小块细胞，因为它保持细胞膜的完整性，其温和的蛋白水解作用使酶可以被特异性用于分离原代细胞和次级细胞（亚培养）。

脱氧核糖核酸酶 I用于消化游离的DNA，防止细胞团聚，同时不损伤细胞。

材料和试剂耗材

实验流程

1、样本准备

1.1、样本活力很大程度取决于样本离体时间，用无菌器械取样后，将组织切成1cm的小块，并立即转移到预冷的组织保护液中。
1.2、样品收集后，用碎冰或冰袋运输（保持在4-8℃），注意不要用干冰运送样品，冷冻会致死细胞。
1.3、样本制备前，将培养皿、刀片、镊子等其他非无菌工具在紫外线下消毒1h灭菌。

2、溶液准备

2.1、蔗糖溶液（1.8 M）：308.07 g蔗糖溶解在300 mL蒸馏水中。
2.2、蔗糖溶液（HBSS溶液）：加入50 mL不含钙或镁的10X Hank's缓冲溶液（HBSS），并使用蒸馏水将总体积调至500 mL，储存在4℃。
2.3、酶解液的配制：每10 mL组织切片需50mL含钙镁的HBSS，加入500 μL 5mg/mL脱氧核糖核酸酶I（终浓度50μg/mL）、500 μL 25 mg/mL Worthington STEMxyme I（终浓度 250 µg/mL）和 500 µL 1M HEPES 缓冲液（混合酶液中可以适当加入10-25U/ mL的Papain）。注：在此步骤中可以使用不同的酶消化溶液混合物。我们还使用了终浓度为25 µg/mL的Liberase DH。
2.4、通过无菌滤膜（0.22 μm）过滤蔗糖和酶消化溶液。37℃水浴中预温酶解液，离心机预冷至4℃

3、组织解离、清洗及裂红

3.1、将组织转移至100 × 20 mm细胞培养皿中，并将组织保存液替换为10-15 mL预冷的培养基。
3.2、使用弯头的止血镊子抓住刀片，将组织切碎，同时去除明显的血管、脑膜等非目的组织。注：最终的组织碎片应1-3mm左右。
3.3、将组织转移到干净的50 mL尖头离心管中。
3.4、用5 mL预冷培养基清洗培养皿，转移至离心管中，根据需要可重复此洗涤步骤以转移更多剩余组织。
3.5、用10 mL血清移液器轻轻吹打（4-5 次），让较大的组织碎片沉淀到管的底部。注：如果含有组织碎屑的管中组织超过5 mL，则将组织分装到其他新的50 mL锥形管中，使得各管中的组织不超过5 mL。
3.6、将含有剩余组织碎片的离心管，离心5 min（350 × g，4℃）。
3.7、吸出上清液，加入预热的酶消化液，每1 mL组织加入5 mL消化液。
3.8、用封口膜密封离心管盖，并在37℃下旋转孵育20 min。
3.9、孵育后，轻轻吹打样品，使用10 mL血清移液管将样品上下吹打6-8次（注：避免产生过多气泡）。
3.10、用1000 μL移液器，再吹打6-8次，冰上静置，将未能消化的组织块沉降到离心管底部。
3.11、取出并过滤上清液，细胞悬液过100 μm筛，放入用于“酶解”的新50 mL离心管中，离心管置于冰上。注：如果重要的组织碎片保留在未过滤的部分中，则向碎片中添加额外的10 mL不含钙和镁的HBSS，并重复步骤3.8-3.10，将额外的HBSS合并到“酶解”管中先前过滤的上清液中。
3.12、将“酶解”管离心5 min（350 × g，4℃），并继续进行蔗糖梯度离心。
3.13、在不含钙和镁的20 mL预冷HBSS中吸出上清液并重悬组织，加入预冷HBSS 使体积达到25 mL。
3.14、缓慢加入25 mL 1.8 M蔗糖溶液并颠倒混合，该步骤会形成0.9 M蔗糖梯度。
3.15、无制动器离心10 min（800 × g，4℃）。注：使用离心制动器会破坏梯度并降低产量。
3.16、小心吸出髓鞘碎片和尽可能多的蔗糖溶液。
3.17、添加30 mL不含钙和镁的预冷HBSS，并轻轻混合清洗样品，通过40 μm细胞筛过滤至离心管中。
3.18、离心5 min（350 × g，4℃），去除洗涤上清液。
3.19、加入5 mL ACK 裂解缓冲液，轻轻重悬细胞沉淀，在室温下转动1 min。
3.20、通过添加10 mL不含钙和镁的冷HBSS来淬灭裂解，离心5 min（350 × g，4℃），弃上清。
3.21、预冷HBSS重悬细胞，5 min（350 × g，4℃）离心收集，使用含有5% FBS的 HBSS 重悬细胞。
3.22、取适量悬液加入染色缓冲液（AO/PI或者台盼蓝）中进行计数质控分析。

结果展示

所获细胞悬液：活率大于90 %，细胞量大于40万，结团率低，背景干净，从细胞形态判断类型丰富。

注意：脑组织样本不宜过长时间保存，所获取的细胞悬液也尽量不冻存后使用，因为冻存复苏对脑细胞悬液活率影响较大。脑组织解离时可以考虑加入5-20U/ mL的Papain配合使用；或者可以选择Papain和DNAse I 配合使用进行解离。

脑组织单细胞悬液制备流程