易基因 | 常用的6种DNA甲基化测序方法，你知道几个？
什么是DNA甲基化？
简单来说，DNA甲基化就是在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上形成5′-甲基胞嘧啶的过程。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育和肿瘤发生发展中起着重要作用，是目前及未来很长一段时间的研究热点之一。
DNA甲基化测序
随着高通量测序技术的发展，我们能够从全基因组水平来分析5’-甲基胞嘧啶及组蛋白修饰等事件，发现很多基因组学研究发现不了的东西，这就是 “DNA甲基化测序”！且近年来测序成本的不断下降及测序技术的迭代更新，DNA甲基化测序方法可选择性更多了。
目前表观遗传学DNA甲基化研究测序方法常见的有：全基因组重亚硫酸盐甲基化测序[WGBS]、精准DNA甲基化和羟甲基化测序[oxBS-seq]、优化版简化甲基化测序[RRBS/dRRBS/XRBS]、单/微量细胞全基因组甲基化测序[scWGBS]、扩增子（羟）甲基化测序、（羟）甲基化DNA免疫共沉淀测序[(h)MeDIP-seq]等6种，适用于不同DNA甲基化研究方向的解决方案。
（1）全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
常规全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
技术优势：
l 应用范围广：适用于人和大多数动植物研究（参考基因组已知）
l 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱
l 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
研究案例：
Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 两种状态的小鼠胚胎干细胞的甲基化组学研究
① 背景
小鼠胚胎干细胞一般生长在含有血清的基质中，被称作血清干细胞(serum ESCs)；加两种激酶抑制因子使胚胎干细胞在无血清的情况下更能保持多能性的基态，这种干细胞称为2i干细胞(2i ESCs)；这两种状态的胚胎干细胞可以互相转化。以前这方面的甲基化研究大多基于质谱，覆盖度和研究结果有限，尚缺乏2i胚胎干细胞的甲基化组学研究。
② 方法
利用全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS），对这两种可互相转换的小鼠胚胎干细胞进行甲基化组学研究
③ 结论
全面准确的检测了两种小鼠胚胎干细胞的DNA甲基化修饰并进行了系统的比较；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs类似呈现全局低甲基化，而在2i ESCs状态下，甲基化水平会进一步降低。
不同状态下小鼠胚胎干细胞的甲基化修饰比较
（2）精准DNA甲基化和羟甲基化测序（oxBS-seq）
DNA羟甲基化是近年发现的一种新的DNA修饰并迅速成为研究热点。随着研究的深入，发现之前被认为是检测DNA甲基化“金标准”的重亚硫酸盐测序并不能区分DNA甲基化（5mC）和DNA羟甲基化（5hmC）。易基因联合剑桥大学建立了化学氧化法结合重亚硫酸盐转化的测序技术（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），该技术不仅可以精确检测DNA甲基化，排除DNA羟甲基化的影响，还可以双文库结合同时单碱基分辨率精确检测DNA羟甲基化。
技术原理：
oxBS-Seq将5hmC氧化5fC，后者可以被Bisulfite转为U，从而实现5mC的精准检测；同时，经过与常规Bisulfite结果比较可以实现对5hmC的准确检测。
技术优势：
l DNA甲基化检测全新的“金标准”
l 全基因组单碱基检测DNA羟甲基化修饰
l 多重标准验证高氧化效率和高Bisulfite转换率
l 实验偏好性低，重复性高（R²>0.98）
l 可满足多种测序应用需求：简化基因组氧化甲基化测序（oxRRBS），目标区域氧化甲基化测序（Target-oxBS）
研究案例：
Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution（oxBS 技术单碱基检测5mC和5hmC在鼠胚胎干细胞中的水平）
① 背景
随着5hmC在哺乳动物基因组中的发现，传统的bisulfite测序已不能精确区分5mC和5hmC的修饰差异，传统BS的测序结果中，5mC的修饰水平实际是5mC和5hmC两者信号的合集，建立一种精确区分两者的实验技术迫在眉睫。
② 方法
利用oxBS测序技术对小鼠胚胎干细胞DNA甲基化和羟甲基化进行检测和定量。
③ 结论
本研究首次建立了通过化学氧化结合重亚硫酸盐处理的实验技术。该技术首先将5hmC氧化为5fC，进而可被重亚硫酸盐转换成U，从而排除了5hmC对5mC的信号干扰，达到精确检测基因组5mC的目的。运用该技术对小鼠胚胎干细胞的研究发现，5hmC在CGI相关的转录调控区域和LINE1元件中含量较高，表明其对表观重编程可能起到重要作用。
5mC和5hmC在小鼠胚胎干细胞基因组不同元件的百分量
（3）简化甲基化测序（RRBS/dRRBS/XRBS）
简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。为了适应科研技术的需要，我们进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。
为助力低样本量多维度分析，我们开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向测序方法：extend-ed-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞。
技术优势：
l 精确度高：在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率。
l 重复性好：多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%，适用于多样本间的差异分析。
l 性价比高：测序区域针对高CpG区域，数据利用率更高。
研究案例：
DNA Methyltransferase Inhibition Reverses Epigenetically Embedded Phenotypes in Lung Cancer Preferentially Affecting Polycomb Target Genes DNA甲基化的改变对癌症细胞侵袭能力的影响
① 背景
癌细胞的表型在一定程度上由表观决定，比如DNA甲基化。癌症发展后期的转移特性可能与表观遗传修饰的改变有关。
② 方法
利用RRBS技术检测具有高侵袭性的非小细胞肺癌细胞系(A549和HTB56)以及相应经过甲基化抑制剂氮杂胞苷（azacytidine）处理过的细胞系的甲基化修饰。探讨甲基化的改变对肺癌细胞系的侵袭能力的影响。
③ 结论
高侵袭性细胞系在发展过程中，DNA甲基化修饰发生了广泛的改变。同低侵袭能力的细胞系相比，RRBS检测到的CpG富集的区域中有2.5%的区域发生了差异修饰。当使用了DNA甲基化抑制剂azacytidine，伴随着这些高甲基化修饰的位点出现甲基化修饰的丢失，细胞系的侵袭能力也发生了逆转。
5-Azacytidine诱导的侵袭能力逆转
（4）单/微量细胞全基因组甲基化测序（scWGBS）
单细胞及微量样本的DNA甲基化组学研究很大程度上受制于建库测序技术。传统的文库构建方法或类似于基因组DNA的单细胞扩增技术很难应用到甲基化实验过程中。易基因建立了基于线性扩增和单管建库的技术，可充分降低文库偏好性，准确的完成珍贵样本的全基因组甲基化研究。
单细胞及微量珍稀样本的甲基化研究主要应用于肿瘤发生机制，癌症研究，胚胎植入前诊断，胚胎早期发育，生殖细胞重组，干细胞及细胞异质性等研究领域。应用的样本包括单细胞、微量细胞等。
技术优势：
l 超低起始量：单细胞或超低的建库DNA起始量
l 测序覆盖度高 ：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱
l 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态
研究案例：
Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos. 人类植入前胚胎发育的单细胞DNA甲基化组图谱
① 背景
在哺乳动物基因组上，胞嘧啶（主要是CpG二连体中的胞嘧啶）在DNA甲基化酶的催化下会发生甲基化。研究显示，DNA甲基化对多个生物学过程都至关重要，如基因表达抑制、转座子转录活性调节、X染色体的失活，以及基因组印记的维持等。此前研究显示在着床前的早期胚胎发育过程中只有大规模的DNA去甲基化。而此次研究数据显示，精子和卵细胞结合受精之后，在人类早期胚胎大规模DNA去甲基化的同时，也在大量高度特异的DNA从头加甲基化，这表明在人类早期胚胎第一轮DNA甲基化组重编程过程中，全局的DNA去甲基化'净结果’实际上是高度有序的大规模DNA去甲基化和局部DNA加甲基化两种分子过程相互拮抗产生的动态平衡的结果。
② 方法
利用单细胞DNA甲基化组高通量测序方法，首次在单细胞分辨率对人类植入前胚胎发育过程进行了更加深入的分析。
③ 结论
在这篇文章中，为了进一步在单细胞水平研究DNA甲基化重编程过程的动态特征，利用单细胞全基因组DNA甲基化组高通量测序技术，对人类植入前胚胎发育的各个关键阶段进行了单细胞、单碱基分辨率的系统研究，主要发现有：（a）首次发现了人类植入前胚胎发育过程中存在大量特异性的DNA从头加甲基。（b）首次发现从二细胞胚胎阶段开始父母本基因组上的剩余甲基化水平发生逆转，在同一个单细胞中母本基因组上的剩余甲基化水平显著高于父本基因组上的剩余甲基化水平。（c）首次发现DNA甲基化在早期胚胎卵裂过程中的不对称分配可以用来追溯同一个胚胎中每个细胞的遗传谱系。
植入前胚胎不同发育阶段DNA甲基化的动态变化
（5）扩增子（羟）甲基化测序
扩增子（羟）甲基化技术针对基因组上特定的DNA序列设计甲基化特异性扩增引物（如感兴趣的基因等），基因组DNA进行（氧化）重亚硫酸盐处理后，PCR扩增检测片段，扩增产物通过二代高通量测序，更精准的检测基因区域的甲基化状态。
技术优势
l 准确性高：可满足几个到上百个基因/CpG 位点的检测，其覆盖范围内可达到单碱基分辨率，覆盖深度超高（位点平均覆盖深度>300X）。
l 性价比高：低成本、周期短，超高性价比。
l 针对性强：适用于特定基因或者位点甲基化状态的检测。
l 应用广泛：广泛用于临床样本多位点的甲基化 Biomarker 筛选、验证及临床转化应用。
研究案例：
Vitamin C Prevents Offspring DNA Methylation Changes Associated with Maternal Smoking in Pregnancy扩增子甲基化测序验证补充维C可减少后代因母亲妊娠期吸烟而发生的DNA甲基化变化
① 背景
妊娠期吸烟可能导致婴儿出生后终生肺功能下降。此前已有不少研究描述孕妇吸烟相关的DNA甲基化变化，如在分娩时的胎盘和脐血、胎儿肺以及儿童时期的口腔上皮和血液中。本研究为确定补充维生素C是否会减少后代因母亲因妊娠期吸烟而发生的甲基化变化。
② 方法
对胎盘、脐带血样本和口腔样本进行靶向亚硫酸氢盐测序，然后使用亚硫酸氢盐扩增子测序对选定的脐带血差异甲基化区域进行独立验证。
③ 结论
安慰剂组和非吸烟者组之间甲基化差异≥10%的大多数CpG（69.03%）在补充维生素C处理后，至少50%可恢复到非吸烟者水平。恢复的CpG中有相当一部分与低甲基化CpG富集程度较高的表型结果相关。
扩增子甲基化覆盖的所有321个CpG是平均覆盖深度的 337 倍
（6）（羟）甲基化DNA免疫共沉淀测序(h)MeDIP-seq
5hmC是新发现的一种的修饰碱基，由TET家族的酶通过氧化5mC产生的。5hmC不仅能够降低MeCP蛋白的甲基化结合结构域(MBD) 与甲基化DNA的亲和性，具有潜在的参与基因表达调控的转录调节功能，而且参与了DNA去甲基化过程。
羟甲基化DNA免疫沉淀测序（Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation Sequencing，hMeDIP-Seq）是通过运用5'-羟甲基胞嘧啶特异性抗体富集羟甲基化的DNA片段，然后结合高通量测序技术在全基因组水平上以较小的数据量，快速、高效地寻找羟甲基化区域。可广泛应用于羟甲基化与疾病关系研究以及羟甲基化在胚胎发育过程中的研究。
技术优势：
l 检测范围广：全基因组范围鉴定甲基化修饰区域
l 针对性强：针对性检测基因组内具有甲基化修饰的区域
l 成本低：大大降低了测序数据量，测序成本低
研究案例：
Genome-wide analysis of 5-hydroxymethylcytosine distribution reveals its dual function in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells 小鼠胚胎干细胞的羟甲基化研究
① 背景
研究证实TET家族蛋白可以催化5mC转化为5hmC。5mC已经被广泛研究，但对5hmC的分布和功能知道的还很少。
② 方法
利用hMeDIP-seq测序技术对小鼠胚胎干细胞的wild-type和Tet1-depleted type的5hmC进行研究。
③ 结论
5hmC在转录活性高的基因的gene bodies区域和受到Polycomb抑制的发育调节因子的启动子区域；5hmC可能在基因表达调控中起着激活和抑制的双重功能。
5hmC在全基因组的分布
以上就是目前表观遗传学研究领域常用的6种DNA甲基化测序方法，如果您不确定自己适合哪种测序方法，可以留言，可提供设计解决方案参考。
参考文献：
（1）Ehsan Habibi, et al. Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. Cell Stem Cell (2013), 13(3), 360‒369.
(2) Booth, M. J., et al. (2012). "Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution." Science 336(6083): 934-937.
(3) Antje Hascher, et al. (2013) DNA Methyltransferase Inhibition Reverses Epigenetically Embedded Phenotypes in Lung Cancer Preferentially Affecting Polycomb Target Genes. Clin Cancer Res; 20(4); 814‒26.
(4) Zhu, P., et al. (2018). "Single-cell DNA methylome sequencing of human preimplantation embryos." Nat Genet 50(1):
(5) Shorey-Kendrick LE, et al. Vitamin C Prevents Offspring DNA Methylation Changes Associated with Maternal Smoking in Pregnancy. Am J Respir Crit Care Med. 2017 Sep 15;196(6):745-755.
(6) Wu H,et al. Genome-wide analysis of 5-hydroxymethylcytosine distribution reveals its dual function in transcriptional regulation in mouse embryonic stem cells. Genes Dev. 2011 Apr 1;25(7):679-84.