ChIP实验重点注意事项

交联染色质

　　DNA-蛋白质的结合并不是非常牢固，为了实验的效果更好，一般通过添加甲醛让DNA和蛋白质交联，让两者结合的更加牢固。但是甲醛有很强的让蛋白质变性的能力，所以需要控制甲醛的用量。

　　实际应用中，是通过直接向细胞培养液中加入甲醛溶液，达到培养液中甲醛含量1%时为适宜，所以培养细胞的培养液的量在实验前需要弄清楚。

　　另外，交联步骤过后，需要用细胞刮收集细胞，所以请尽量把细胞培养到一个容器里交出来做CHIP实验。

　　超声波剪断染色质

　　在进行免疫共沉淀之前，需要把染色质破碎到大部分碎片上DNA长度在200~1000个碱基对。

　　在这一步，我的改进是用较低的超声破碎仪功率，设置时间梯度，来筛选比较好的破碎程序。

　　左图第一泳道是marker，第二泳道是总染色质，第三至第六泳道依次是破碎30s到120s,可见破碎120s效果最好。

　　CHIP实验正对照

　　CHIP实验正对照有两个方面：免疫共沉淀使用乙酰化H3的抗体;PCR检测使用GAPDH启动子对应的引物，目的片段长度为167bp。

　　上图第一泳道是marker，第二泳道是input的PCR结果，第三泳道是CHIP实验正对照。

　　根据指标设计CHIP引物

　　CHIP实验一般瞄准的是基因的启动子区域，这一部分相对于基因翻译区，信息要模糊的多，可以通过NCBI上的gene browser来辅助分析，一般可以在转录起始区域上游100~1000bp选择。但是还是需要至少设计两组引物,从中选择效果较好的。

　　如左图所示，前三个泳道和后三个泳道是同一个基因启动子的不同引物，效果上有明显差距。