文献精读：仑伐替尼靶向FGFR4增强肝癌PD-1抑制剂疗效机制新发现
精读出处：Hepatology. 2021（26）. Epub ahead of print. PMID: 34036623.
近年来，靶向药物与免疫检查点抑制剂（ICIs）的联合方案层出不穷，并在肝细胞癌（HCC）中取得了确切的疗效，彻底改变了治疗格局。但同时，联合方案的具体作用机制尚未被清晰地认识。5月26日，一项由复旦大学附属华山医院普外科、消化科和感染科等各学科组成的多学科团队牵头开展的研究在Hepatology杂志上在线发表。该研究首次揭示了仑伐替尼联合PD-1抑制剂的独特机制，并得到了临床上的初步验证，从而为仑伐替尼联合PD-1抑制剂治疗HCC的方案新增了强有力的理论证据。此外，该研究还提出了潜在的疗效预测标志物，为临床筛选接受仑伐替尼联合PD-1抑制剂的优势人群提供了指导。本期特邀本项研究的通讯作者——复旦大学附属华山医院普外科陈进宏教授为大家详细解读这项研究。
陈进宏 教授
复旦大学附属华山医院
主任医师，博士生导师，医学博士
十三五重大科技专项负责人
上海市医学会肝脏外科学组副组长
上海市杰出青年医学人才
世界腹腔镜肝脏学会创始会员
中华医学会外科学分会青委会委员
中华医学会外科学分会脾和门脉高压学组委员
中国医师协会外科医师分会机器人委员会青委会委员
中国医师协会结直肠癌肝转移专委会副秘书长
中国研究型医院分子诊断医学专业委员会委员
中国医药教育协会肝胆胰专业委员会委员
该研究挖掘的机制模型：
图1: Hepatology. 2021(26). Epub ahead of print. PMID: 34036623.
途径1：效应T细胞在免疫激活后释放促炎性细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-2（IL-2）。IFN-γ通过与其受体结合上调肿瘤PD-L1表达。然而，仑伐替尼可阻断FGFR4信号转导使GSK3β在Ser9位点去磷酸化，通过激活GSK3β，促进PD-L1在HCC细胞中的泛素化降解。
途径2：仑伐替尼可阻断幼稚T细胞中的FGFR4表达，以防止STAT5磷酸化，从而降低IL-2/CD25轴诱导的Foxp3转录，抑制Tregs分化。
从临床现象中发现问题
仑伐替尼降低HCC中PD-L1表达和Treg浸润
与原发肿瘤相比，不接受任何治疗的、短期复发肿瘤的PD-L1表达和Treg浸润水平相似，若复发肿瘤患者接受了仑伐替尼新辅助治疗，PD-L1表达和Treg浸润水平降低（图2）。小鼠模型证实仑伐替尼降低肿瘤PD-L1和Foxp3的表达，同时增加CD8+ T细胞的肿瘤杀伤细胞因子IFN-γ和GZMB的分泌。
体外试验表明仑伐替尼抑制了PD-L1蛋白质水平表达，而PD-L1的mRNA水平表达不受仑伐替尼的影响。这些结果表明仑伐替尼可降低PD-L1蛋白表达和Treg浸润，增强PD-1抑制剂的抗肿瘤效应。
图2: Hepatology. 2021(26). Epub ahead of print. PMID: 34036623.
利用基础研究深挖潜在机制
途径1：仑伐替尼可促进PD-L1降解
1.1. 仑伐替尼对PD-L1的下调依赖于靶向FGFR4
进一步探索仑伐替尼下调PD-L1的作用机制。研究者在TCGA-LIHC数据库中分析仑伐替尼的靶点，发现VEGFR1，FGFR4是各自亚型中表达最高的基因。于是，研究者在HCC细胞系中敲除FGFR4、VEGFR1、PDGFRA、KIT和RET，评估这些靶点对PD-L1蛋白表达的影响。
在HCCLM3和HepG2细胞中，PD-L1蛋白质水平仅在敲除FGFR4后降低，该作用可被FGF19（FGFR4的配体）抵消，表明仑伐替尼通过靶向FGFR4抑制PD-L1蛋白质的表达（图3）。
然而，仑伐替尼、FGFR4敲除或FGF19只影响FGFR4的mRNA水平而不是PD-L1的mRNA水平。此外，仑伐替尼对PD-L1的下调作用与FGFR4的表达呈正相关。FGF19导致的PD-L1升高也与这些细胞中FGFR4的表达呈正相关。这些结果表明仑伐替尼对PD-L1的下调依赖于靶向FGFR4。
图3: Hepatology. 2021(26). Epub ahead of print. PMID: 34036623.
1.2. 仑伐替尼通过靶向FGFR4促进PD-L1的泛素化降解
由于仑伐替尼和FGFR4敲除对PD-L1转录几乎没有影响，本研究进一步探讨了仑伐替尼是否影响PD-L1蛋白质的稳定性。
研究发现，仑伐替尼和si-FGFR4处理能够显著缩短HCCLM3细胞中PD-L1蛋白的半衰期。
蛋白酶体抑制剂PS-341而非溶酶体抑制剂氯喹（CQ）能够恢复仑伐替尼、si-FGFR4或FGFR4抑制剂FGF401对HCCLM3细胞的PD-L1抑制作用。
HCCLM3细胞中，FGF19使PD-L1和p-GSK3β (Ser9) 上调，但能被仑伐替尼以剂量依赖性方式中和。GSK3β抑制剂LiCl和FGF19可阻止由仑伐替尼引起的PD-L1降解。此外，在仑伐替尼、FGF401（FGFR4抑制剂）或si-FGFR4处理的HCCLM3细胞中，带Myc标记的外源性PD-L1减少。泛素化试验表明仑伐替尼、FGF401和si-FGFR4均促进外源性PD-L1泛素化，而FGF19可抵消它们的作用。
综合表明，仑伐替尼靶向FGFR4阻止GSK3β在Ser9的磷酸化，促进了HCC细胞中PD-L1的泛素化降解。
1.3. 体外仑伐替尼通过靶向FGFR4恢复了IFN-γ预处理的HCC细胞对T细胞杀伤的敏感性
体外研究进一步深入探索T细胞与肿瘤细胞间的相互作用。结果显示，经IFN-γ预处理的HCC细胞发生适应性免疫耐受，对T细胞杀伤不敏感。然而经过仑伐替尼预处理的HCCLM3细胞对T细胞介导的杀伤作用更敏感且抵消IFN-γ诱导的T细胞沉默。
此外，敲低FGFR4增敏了HCCLM3细胞对T细胞介导的杀伤，且该作用可被FGF19逆转。
因此，IFN-γ和FGF19介导HCC细胞从T细胞杀伤中逃逸，而仑伐替尼通过降低FGFR4恢复了肿瘤对T细胞杀伤的敏感性。
途径2：仑伐替尼可抑制Tregs分化
2.1. 仑伐替尼靶向FGFR4抑制Tregs分化
Foxp3+是一类特异性表达于Treg细胞中的转录因子，是Treg细胞的典型标记物。分析肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）发现：Foxp3+ CD4+T细胞在PD-1抑制剂治疗后增加，加入仑伐替尼后降低。这个现象同时也在小鼠外周血淋巴细胞中发现，这表明仑伐替尼抑制了Treg细胞的分化和稳定性，而不是影响了肿瘤对Treg细胞的趋化性。
研究进一步分析了六种与Treg细胞谱系发育相关的细胞因子（L-2、IL-6、IL-18、IL-33、TGF-β1和TNF-α）的水平。ELISA和IHC结果显示PD-1抑制剂和仑伐替尼治疗组肿瘤上清液中IL-2的水平升高，猜测这是Treg细胞浸润增加的原因，但仑伐替尼可能会阻断其下游途径。
在IL-2和TGF-β1的存在的情况下，仑伐替尼抑制了幼稚CD4+ T细胞向Treg的转化。仑伐替尼的加入显著阻止了由IL-2介导的Treg分化，但对TGF-β1介导的分化影响很小。
进一步试验证实仑伐替尼和si-FGFR4可降低IL-2诱导STAT5磷酸化，干扰幼稚CD4+T细胞向Treg细胞的分化，但该作用能被FGF19逆转。
上述研究证实，仑伐替尼治疗通过靶向FGFR4抑制STAT5的磷酸化从而抑制幼稚T细胞分化为Treg细胞(图4)。
图4: Hepatology. 2021（26）. Epub ahead of print. PMID: 34036623.
回归临床予以验证
HCC中FGFR4表达和Treg浸润水平与联合治疗疗效相关
通过免疫组化在85个HCC样本中探讨了FGFR4或Foxp3与颗粒酶B表达的临床相关性。颗粒酶B主要在经典的细胞毒性CD8+ T细胞（CTL）上表达，并与抗肿瘤免疫相关。正如预期的那样，FGFR4的表达与p-GSK3β (Ser9) 水平（P＜0.01）和PD-L1状态（P＜0.01）呈正相关，但与颗粒酶B水平呈负相关（P＜0.01）。此外，Foxp3的水平与颗粒酶B水平呈负相关（P＜0.01）。结果表明在人体HCC中，FGFR4高表达或Treg高浸润与免疫耐受相关。
进一步检验FGFR4表达或Treg浸润水平与联合治疗效果的关系，通过手术切除或者活检采集32名接受联合治疗HCC的原发肿瘤标本。15名（46.9%）患者对联合治疗有反应，中位数PFS为5.1个月，而17名（53.1%）患者没有反应，中位PFS为3.0个月（p=0.024）。大多数高FGFR4和高Foxp3的肿瘤患者对联合治疗应答（5/6），而大多数低FGFR4和低Foxp3的肿瘤是无反应者（10/13）。因此，FGFR4表达和Treg浸润可能是预测HCC对联合治疗疗效的生物标志物。
仑伐替尼通过阻断FGFR4，减少肿瘤PD-L1表达和抑制Treg分化，从而提高PD-1抑制剂疗效。FGFR4表达和Tregs浸润可能作为筛选仑伐替尼联合PD-1抑制剂治疗优势人群的生物标志物。
“From Bed to Bench, From Bench to Bed”，研究的成果产生实际的价值。陈进宏教授的这项研究是从“Bed”开始，在临床上发现了一个现象，然后转战到“Bench”，再从“Bench”转战到“Bed”，在临床上证实了体外和动物模型上的研究结果。这项研究的来源是两例手术后短期内复发的HCC患者。陈进宏教授团队发现这两例复发患者在服用了两个月左右的仑伐替尼后，肿瘤有稳定甚至缩小的趋势，让再次手术成为可能。而对比两例患者术后肿瘤样本和服用仑伐替尼两个月以后的样本发现，服用仑伐替尼后患者的PD-L1和Foxp3表达降低。基于这样一个现象，陈进宏教授团队从基础实验深挖现象背后的机理，开展了此项研究。
作为联合方案之一，仑伐替尼联合免疫治疗在临床研究中取得了令人鼓舞的结果，KEYNOTE-524研究显示仑伐替尼联合帕博利珠单抗一线治疗晚期HCC的客观缓解率（ORR）为46%。但是业界对于联合治疗方案作用机制的摸索尚浅，仅限于抗血管生成药物具有调节免疫的作用，可以使血管在一定“时间窗”内正常化，从而促进改善肿瘤免疫微环境，与免疫治疗药物形成协同作用。因此，亟需了解其具体作用机理，在摸清机制的基础上才能更好地开展临床研究。
这项研究从仑伐替尼的作用靶点包括VEGFRs、FGFRs、PDGFRA、KIT和RET入手，试图阐述潜在机制。体内和体外实验发现仑伐替尼可降低PD-L1的表达，敲除FGFR4可显著降低PD-L1蛋白表达，FGF19几乎可以恢复仑伐替尼引起的PD-L1下调。根据现有数据，在HCC中不能完全排除FGFR1、FGFR2和FGFR3会像FGFR4一样影响PD-L1水平的可能性。然而，在HCC细胞系中，FGF19几乎可以恢复仑伐替尼引起的PD-L1下调。这些数据支持FGFR4是仑伐替尼下调PD-L1表达的最重要靶点。仑伐替尼和FGFR4敲除导致GSK3β在Ser9去磷酸化，激活GSK3β，从而通过蛋白酶体途径促使PD-L1降解，这种作用可被FGF19逆转。共培养实验进一步证明仑伐替尼阻断FGFR4并随后降解PD-L1，从而增强T细胞的杀伤能力。此外，进一步探索了仑伐替尼联合PD-1抑制剂治疗期间Tregs的变化机制，结果证明仑伐替尼干扰通过靶向FGFR4/STAT5轴干扰CD4+ Foxp3+T细胞分化。从药理学上看，仑伐替尼对FGFR4具有较强的阻断作用，这也为仑伐增强免疫治疗的疗效提供了机制层面强有力的解释。
从“Bench”再回到“Bed”，陈进宏教授团队发现FGFR4表达和Tregs浸润都高的小鼠接受仑伐替尼联合PD-1抑制剂治疗的疗效更好，并在临床队列中验证了该结果。因此FGFR4表达和Treg浸润水平可能用于筛选对仑伐替尼联合PD-1抑制剂有更大获益的患者。
该项研究发表后，Llovet教授[1]在同一杂志发表的文章（Immunomodulatory effects of lenvatinib plus anti-PD1 in mice and rationale for patient enrichment in hepatocellular carcinoma）也提出了相似的仑伐替尼联合抗PD-1抑制剂免疫调节的机制——激活免疫通路，减少Treg细胞浸润，抑制TGF-β通路，从基因测序角度证实了研究结果。
可见，仑伐替尼的免疫微环境调节作用和精准治疗生物标记物的探索已然成为研究的热点话题。本研究揭示了仑伐替尼联合PD-1抑制剂的全新机制，通过靶向作用FGFR4抑制PD-L1表达并减少Tregs浸润。这些发现提供了加入仑伐替尼治疗以增强PD-1抑制剂对HCC疗效的新见解。此外，FGFR4和Tregs有可能作为选择更能从仑伐替尼联合PD-1抑制剂治疗中获益的HCC患者的生物标志物。但需要强调的是，仑伐替尼通过FGFR4发挥免疫调节作用只是可能的一种机制，还有很多潜在机制需要进一步探索，同时需要更多的大型Ⅲ期随机对照试验来验证生物标志物的结论。
参考文献：
[1] Hepatology. 2021 (22). Epub ahead of print. PMID:34157147.