如何构建稳定转染的细胞系(株)？

稳定细胞株构建包含哪些关键步骤？

A：如下

♀ 一般稳定细胞株的构建包含以下几个部分：

表达之类构建

细胞转染

pool细胞筛选

单克隆筛选

细胞库建立

表达质粒构建

A：如下

♀ 将带有内切酶位点的抗体轻重链碱基序列通过聚合酶链反应(PCR) 方法合成，然后与载体连接构建表达质粒，抗体的轻重链可放在不 同载体上。为保证克隆到载体中的靶基因的准确性，在转染宿主细胞前需对表达质粒中 的靶基因进行测序。

细胞转染

A：如下

♀ 将表达质粒通过四种不同的方法（化学法、物理法、脂质体转染、病毒转染）导入哺乳动物细胞内，最为常用的是电穿孔转染法、脂质体转染法和聚乙烯亚胺介导的转染方法。转染的成功率取决于细胞的活性、质粒DNA 的纯度、转染试剂及转染方法。

Pool细胞筛选

A：如下

♀ 细胞池筛选与评估：转染后的细胞需要在选择性培养基中培养至活率完全恢复，用以产生稳定的细胞池。选择试剂的使用取决于表达载体携带的选择基因及宿主细胞的类型。过于CHO K1细胞，通常不含谷氨酰胺的培养基中添加MSX进行筛选；而DG44和DXB11细胞通过不含呈甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶，并对细胞池增加MTX的选择压力来提高抗体表达水平。在细胞池筛选阶段，需要对细胞池表达抗体的产量和关键质量进行评估，根据评估结果选择3-4个细胞池进行克隆。

单克隆筛选

A：如下

♀ 单克隆筛选与评估：传统的单克隆筛选方法多采用有限稀释法，形成率呈泊松分布。为保证单克隆的单一性，需要一轮以上的克隆筛选，通常低于1个细胞/孔的方法进行铺板，挑选300个克隆经过24孔板、6孔板、T方瓶的摇瓶逐级扩增，最后挑选出10-20个克隆进行摇瓶规模评估，根据细胞生长和产物质量特性，挑选出4-6克隆进一步在反应器中评估，并建立RCB。

三级细胞库的建立

A：如下

♀ 细胞库的建立为满足大规模抗体生产的需要。根据生物反应器评估结果及细胞株稳定性研究数据，选择生产用工程细胞株及备选细胞株，并建立原始细胞库PCB，然后GMP条件下建立主细胞库和工作细胞库。