工程菌构建：关于PCR，你知道多少？酵母也可以菌落PCR了
一、PCR技术的原理
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
1、模板DNA的变性
模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
2、模板DNA与引物的退火（复性）
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
3、引物的延伸
DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
二、PCR系统的基本要素
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。
三、提高PCR反应特异性的措施
PCR特异性 (specificity)是指PCR反应的产物只产生预期的靶序列，不含非目标靶序列的DNA片段。理想的PCR反应除了忠实性高，还应该体现为高度特异性和高效性，高效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。提高，PCR反应的特异性的措施有以下几方面:
1、引物设计引物长度适当
引物长度一般为18~24bp，并保证序列独特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性。长度大于24bp的引物并不意味着有更高的特异性，较长的序列可能会与错误配对序列杂交，反而降低特异性，而且长序列比短序列杂交慢，影响产量。引物的浓度会影响特异性，最佳的引物浓度一般在0.1~0.5umol/L，较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。
2、提高退火温度PCR的退火温度
退火温度设定一般由引物Tm决定，退火温度一般设定为比引物的Tm低5°C。在理想状态下，退火温度应足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合，因此，需要找到这个温度的均衡点。采用梯度PCR仪可以对PCR反应的退火温度进行优化筛选，确定特异性最好的退火温度。
3、合适的Mg2+浓度
较高的Mg2+浓度可以增加产量，但也会降低特异性，为了确定最佳浓度，可以将Mg2+浓度从1mmol/ L到3 mmol/ L， 以0.5mmol/L递增，进行最适Mg2浓度的测定。
4、添加PCR辅助剂
甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等都可充当PCR的增强剂，其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区，但是增强剂浓度要适当，否则会降低PCR的产量。
5、改进PCR策略
通过改进PCR策略，如采用巢式PCR、融合PCR
四、PCR常见问题及解决方式
1、酵母菌落PCR技术
问：酵母可以直接挑取单菌落进行PCR验证筛选？
答： 当然可以
01、传统观点
1）酵母是一种重要的基因工程宿主菌,但是由于其细胞壁结构复杂牢固,普通的菌落PCR方法的成功率较低。
2）传统的酵母阳性菌株鉴定方法
从抗性平板中挑选选转化子，提取酵母基因组，以基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。
3）传统鉴定方法的缺点
目前市面上的酵母基因组提取在时间上需要摇菌扩培1天，提取酵母基因组需要半天时间，同时由于酵母质粒的拷贝数本来就低，即使提取出来，基因组浓度也很低，为后续做PCR鉴定提供的模板量少。
02、新的技术
可以直接挑取单菌落进行PCR来验证筛选阳性转化子，瑞源生物这款试剂盒将是酵母菌构建人的福音了。
2、PCR出现假阴性
PCR 反应出现假阴性结果，无扩增条带的4个原因：1
01、模板
① 模板中含有杂蛋白质;
②在提取制备模板时丢失过多，量不够;
※ 在酶和引物质量好时，不出现扩增带，在程序固定不变的情况下，模板的质量不高。
02、酶失活
需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或电泳时忘记加溴乙锭。
03、引物
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。对策为：
① 选定一个好的引物合成单位;
②引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
③引物设计不合理，如，引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
04、物理原因
变性对PCR 扩增来说相当重要，如，变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
3、 PCR 非特异性扩增带的原因与对策
PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。可能出现的原因有以下几点：
1）引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体;
2）Mg2+离子浓度过高、退火温度过低及PCR循环次数过多有关;
3）其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增;
4）其对策有：
必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
4、PCR 反应出现片状拖带或涂抹带
1）PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
2）其对策有：
①减少酶量，或调换另一来源的酶;
②减少dNTP的浓度。增加模板量，减少循环次数。