全基因组测序在遗传病检测中的临床应用专家共识
遗传病是指由于基因或基因组的结构或功能改变所导致的疾病。下一代测序（next-generation sequencing,NGS）是遗传病检测领域的一项革新性技术。近年来靶向测序和全外显子组测序（whole exome sequencing,WES）得到广泛认可，逐渐成为辅助医生进行遗传病诊断的重要工具。这些检测手段尽管有效，仍然存在一些技术限制，特别是在检测结构变异（structural variations,SV）等方面。全基因组测序（whole genome sequencing,WGS）有望进一步提升临床遗传检测的效能。WGS对受检者基因组中的全部DNA序列进行检测，较WES所覆盖的区域更广，不仅覆盖了几乎全部基因的外显子序列，也覆盖了内含子序列和基因间序列。现在认为WGS可有效避免在对相关基因组区域进行靶向富集时产生的技术偏差，不仅可以检出单核苷酸变异（single nucleotide variations，SNV），还可以对SV进行分析，并常规性地对线粒体基因组（mitochondrial genome DNA,mtDNA）变异进行分析。同时其操作步骤相对简化，能更加快速地获得更完整的基因组信息。因此，WGS应用于临床遗传诊断有望提高诊断率，缩短诊断流程，节省时间及降低诊疗费用。
由于WGS产生的数据涉及受检者的几乎全部遗传信息，其应用于临床遗传病检测需遵循医学伦理中的自愿、患者受益、不伤害和公平原则。为了实现其应有的临床意义，并妥善处理检测可能带来的复杂遗传咨询问题，本共识列出了WGS作为遗传病诊断检测手段的关键特征，并在检测申请、检测及分析流程、报告及遗传咨询等方面给出建议，但其实施流程及效能验证的具体步骤不在本共识的涵盖范围。本共识适用于以NGS技术为主的高覆盖度WGS（通常>40X）在遗传病临床诊断性检测中的应用，主要针对符合孟德尔遗传规律的基因或基因组疾病。对于WGS在预测性检测、筛查等场景中的应用，不在本共识的讨论范畴。
一、送检目的及临床适应证
1．送检目的：
本共识认为WGS可用于以下送检目的，（1）临床诊断不明但怀疑为遗传病的患者，通过WGS寻求相关的分子诊断和鉴别诊断；（2）临床诊断明确的遗传病患者，为进一步指导治疗或生育寻求分子水平的确诊。
2．临床适应证：
WGS适用于怀疑遗传病是患者全部或部分症状原因的所有情况。（1）推荐WGS，①高度怀疑患者有遗传病的可能（如临床症状、体征和其他检测结果提示，家族史阳性或近亲结婚家系），但先前经过如染色体核型、微阵列芯片或全外显子组测序等一种或多种遗传学检测未获得明确的分子诊断；②患者表型为非特异性[不明原因的智力落后和（或）发育迟缓、非已知综合征的多发畸形等]或临床诊断明确但目标疾病遗传异质性高（先天性白内障、腓骨肌萎缩症、脑白质病等），为获得时间或经济效益而寻求一次性、全面性的遗传学检测（新生儿重症患儿等）。（2）可使用WGS，但应结合具体情况选择优先的检测方法：目标疾病遗传异质性低，虽已有公认的靶向检测方法，但有可能部分致病变异（非编码区变异等）不在靶向检测的范围（神经纤维瘤1型等）。（3）不推荐使用WGS，①目标疾病致病基因的相当一部分变异类型不在WGS检测范围，例如Beckwith-Wiedemann综合征等基因印迹疾病；②目标疾病致病基因存在同源区域等情况，如先天性肾上腺皮质增生（CYP21A2基因相关）等。
二、检测前咨询
1．遗传咨询的必要性：
受检者在进行WGS前，原则上应由接受过医学遗传学培训的临床医生（含继续教育）或遗传咨询师进行遗传咨询以明确检测目的，了解检测方法及其局限性，知晓预期结果和可能的风险，并知悉数据及样本的相关处理。
2．检测前遗传咨询及知情同意的内容：
在WGS检测前进行遗传咨询有助于受检者充分知情，建议以书面的形式获得受检者或其监护人签署的知情同意书。遗传咨询及知情同意的内容应包括：（1）送检的目的及意义；（2）检测方法、周期及局限性；（3）预期结果及可能的风险：检测结果可能为阳性，即在与受检者表型相关的基因中找到致病性变异；阴性，即未发现与受检者表型相关的致病性变异；或结果不确定，即在与受检者表型相关的基因中找到意义不明的变异，或在与受检者表型可能相关但是不确定的基因中找到致病性变异。受检者应知悉次要发现的可能及其意义和风险，确认"不知权"。检测过程中及知晓结果后，受检者可能会出现不同程度的精神压力和心理负担；（4）数据及样本处理的相关规则；（5）数据再分析的可能性。
三、检测流程
1．信息和样本采集：
检测前应收集尽可能详细的表型信息。表型信息包括临床症状、体征、实验室检查、病理检查和影像学及其他检查结果等。建议使用人类表型标准用语（human phenotype ontology，HPO）或中文人类表型标准用语（China human phenotype ontology，CHPO）等统一术语。家族史信息收集建议达到三代或三代以上，对于家族史阳性的，应详细记录每个患者的表型信息，含发病年龄、轻重程度等。临床医生与实验室和受检者沟通后，可以在缺乏部分辅助检测结果的情况下先提供WGS检测，然后在结果分析时或分析后针对性地对患者进行检查。样本采集应按实验室要求，采集含基因组DNA的生物样本，包括但不限于全血、组织、培养的细胞等。
2．标准操作程序（standard operating procedure,SOP）的建立及检测性能确认：
检测机构需建立符合相关规定的SOP。此SOP需对每一个环节的质控和操作关键参数有明确界定。检测性能确认时建议采用国际通用的标准样本，以已确认的变异为对象，分析界定其对不同变异类型的敏感性、特异性，并对检测性能的稳定可靠性做批间、批内的差异分析，界定可接受和可报告的范围。应遵循SOP进行检测及质控。操作流程中的重要成分或处理方法有改变时应对检测性能进行再次确认，并记录与原SOP的主要差别和改进。实验室SOP及其性能确认报告应为含有效期和版本号的书面文本，以备培训、操作时参阅和检查时展示递交。
3．确认性实验：
用于诊断目的的变异检测结果，建议经过确认性实验后报出。确认性实验目的一为排除样品混淆等人为错误，二为排除变异的假阳性。（1）样本真实性的追踪及确认。为了排除样本混淆的风险，实验室应建立样本追踪方案，如通过单核苷酸多态性（SNP指纹图谱）来确认送检样本与数据相符。（2）用于诊断目的的变异确认。对于SNV、拷贝数变异、SV和mtDNA变异，可以根据涉及变异的位置和特性选择适合的方法进行确认，如Sanger测序确认SNV、微阵列芯片或多重连接探针技术等确认拷贝数变异、核型分析和荧光原位杂交等确认SV、特异性高的mtDNA检测确认线粒体基因组变异。对变异进行确认性实验时，应考虑到不同方法间灵敏度的差异，如WGS可检出等位基因频率占比低的嵌合性变异，但此类变异可能无法通过Sanger测序检出及确认。（3）对新发变异应通过父母亲源关系检测确认。
4．检测的局限性：
WGS检测的局限性主要包括，（1）涉及高度重复或同源的基因组区域的检测及分析可能不准确。在染色体着丝粒DNA、着丝粒旁的异染色质、端粒、亚端粒区间或线粒体基因组等高度重复或同源的区间，较短的读长在与参考基因组进行比对时可能存在不唯一性。这些区域还存在活跃的重组，也会增加比对难度。临床常见的与高度重复或同源基因或基因组相关疾病包括耳聋（STRC基因相关），先天性肾上腺皮质增生（CYP21A2基因相关），Lynch综合征（PMS2基因相关）等。（2）对于mtDNA变异识别存在局限性，需用特异性高的mtDNA检测方法进行验证。原因是线粒体基因组变异有杂质性的特点。准确区分同质性和杂质性，以及测定杂质性的水平对于线粒体基因组变异的分类有非常重要的意义。由于线粒体基因组存在大量与核基因同源的序列，WGS测序可能出现mtDNA变异假阳性、不能准确区分同质性和杂质性以及不能对杂质性进行准确定量的情况。（3）人类基因组参考序列仅来源于有限个体，部分基因组区域还存在参考序列的误差和空白间隙，变异识别可能出现假阳性和假阴性。（4）鸟嘌呤和胞嘧啶（guanine and cytosine,GC）占比高区域的覆盖可能不完全。WGS的覆盖均一性虽较捕获测序有显著改善，但由于基因组构型的复杂性，高GC含量区域的变异评估应谨慎。（5）部分变异类型，如环状染色体等复杂结构变异，WGS的检出率及准确性仍有待进一步的确认。
值得一提的是，上述讨论的局限性并非一成不变，由于技术及算法的改进，这些局限性相关的问题在将来可能得到解决，例如某些涉及高度同源基因的疾病已有通过NGS方法进行检测的文献报道。