NASH疾病FXR激动剂的公斤级别工艺解析
非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一种严重的慢性肝病，其特征是进行性纤维化，可导致肝硬化、肝功能衰竭和死亡。化合物1是一种法尼酯X受体（FXR）激动剂，已被研究用于治疗NASH。本文主要介绍化合物1的公斤级规模放大工艺的开发相关工作。同时，还对工艺过程中产生的杂质进行了相关的研究。
非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一种慢性肝病，其特征是进行性纤维化、脂肪变性和肝细胞膨胀/炎症，可发展为肝硬化、肝功能衰竭和/或需要进行肝移植。同时，NASH估计会影响3-6%的美国人口。法尼酯X受体（FXR）主要在肝脏、胃肠道和肾脏中表达。FXR激动剂已被证明可以改善上述NASH的代谢特征，并且越来越多的FXR激动剂已被证明具有适度的临床疗效，包括奥贝胆酸（OCA）和cilofexor（CILO），一种与上述分子相关的治疗剂。化合物1是一种有效的FXR激动剂，作为NASH和其他炎症性肝病的可能治疗药物。本文首次描述化合物1公斤规模生产工艺开发的相关工作。
化合物1的逆合成分析以及路线的评价（Scheme 1）。通过逆合成分析发现，可通过起始原料2-5，经SNAr、Grignard反应和烷基化反应，从而合成化合物1（Scheme 1a）。同时，作者评估了两条合成化合物1的路线。在Route 1中，化合物6与镁试剂交换并加成至氮杂环丁酮3中，生成中间体7。在Route 2中，化合物8与化合物5进行烷基化反应，生成生成中间体7，可避免中间体的镁化过程。对于上述两条路线，最终均需通过化合物2与中间体7的SNAr反应，从而获得最终产物1。
在Route 1中化合物6是通过镁试剂交换反应将Grignard加成到Boc保护的氮杂环丁酮3中（Scheme 2）。在化合物6与i-PrMgCl·LiCl的镁-溴化物交换实验中，仅需在0℃下反应18h，即可实现>99%的转化率。同时，由于原位脱金属化和过度加成，导致约17%的杂质生成。最后，在通过p-TsOH·H2O可去除Boc后，导致下一步的杂质增加。因此，作者探索了Route 2。
Route 2的评估（Scheme 3）。作为第一批化合物1的放大用于毒理学研究，可实现汇聚合成。同时，化合物8的合成使用了一种简化的Grignard反应底物，有望提高工艺性能和稳定性。在此路线中，使用TBS护基团进行功能化，但在放大时却存在一定的挑战，如通过两次硅胶柱色谱操作，并使用了TBAF（一种与玻璃反应器不相容的吸湿性试剂）。因此，仍需寻找一种可替代的保护基团。
由于TMS基团易于引入和除去，作者选择了TMS作为保护基。因此，作者以化合物4为底物，先通过TMSCl和i-PrMgCl·LiCl进行保护形成Grignard试剂中间体12，再与化合物3进行1,2-加成反应，即可获得化合物8（Scheme 4）。同时，在实验室规模（最多130g）下可获得81%收率和97%的纯度，但在放大时反应转化率低于预期，可能是由于化合物3的低聚造成。虽然TMS保护策略操作简便，但也增加了杂质生成的风险。因此，仍需对保护基团进行筛选。
通过对大量苯酚保护基团的研究后发现，4-吗啉羰基可作为良好的保护基（Scheme 5）。首先，化合物4可以有效地转化为氨基甲酸酯13，通过加水可直接结晶。随后，化合物13与镁试剂交换，再与化合物3反应，再经乙酸水溶液处理后得到结晶化合物14。此外，作者还研究了各种有机镁试剂、添加剂、溶剂和温度（Table 1）。其中，i-PrMgCl·LiCl作为最佳Grignard试剂。最后，化合物14经碱性水解以及结晶，获得92%收率的化合物8，纯度>99%。
在获得了化合物8之后，下一步是通过化合物5的氯化和烷基化形成中间体9（Scheme 6）。甲苯是氯化反应合适的溶剂，在反应或后处理过程中不会导致HCl和SO2的排放。在5 ℃下加入SOCl2并加入到苛性碱洗涤器会导致控制器放热。氯化按比例增加到5 kg，可生成15的甲苯溶液。
同时，通过化合物8与化合物15的烷基化中溶剂的筛选后发现（Table 2），使用MeCN作为溶剂，可将杂质16的量降至0.4%。在放大之前，预计反应混合物的异质性会导致反应时间增加，因此评估了向反应混合物中添加水以溶解无机盐的情况。当使用MeCN/H2O混合溶剂时，可将转化率提高至100%，杂质降低至0.1%。然而，通过加入水使杂质形成最小化，但观察到15和5的不同水解。最终，作者还是选择了在无水反应条件进行放大，从而获得91.8%收率的化合物9，杂质16为0.5%。反应混合物用MTBE稀释，用氢氧化钠水溶液洗涤，然后用氯化钠溶液洗涤，有机流直接进入Boc脱保护而无需分离。
化合物8与15的烷基化反应研究（Table 3）。当使用n-Bu4NI为相转化催化剂时，其反应性能可与MeCN中的标准条件相媲美。然而，这些未优化的条件在控制杂质16的形成方面并没有明显的优势，并且需要去除铵盐，因此需要额外开发来实施PTC以用于未来的放大。
N-Boc保护化合物9脱保护形成甲苯磺酸盐7（Scheme 7）。中间体9进行溶剂交换成i-PrOH，并在50℃下用p-TsOH·H2O处理。反应后，只需冷却至0℃，化合物7就可直接从反应混合物中结晶出来。在公斤级实验中，从化合物5开始，经三个步，可获得88%收率的p-TsOH盐7，纯度为99%，杂质17为0.6%。
SNAr加成和化合物1的合成。化合物7与6-氯吡啶衍生物2经SNAr反应，可形成化合物18（Scheme 8）。同时，通过对SNAr反应中碱的筛选表明，当使用可溶性胺二异丙基乙胺、三乙胺和DABCO时，仅有三乙胺的收率较高。同时，反应也存在两个芳基-F键位点的SNAr副反应，产生的两种杂质：杂质19和杂质20。
因此，选择三乙胺作为碱，并评估了溶剂特性对反应转化率和纯度的影响（Figure 1）。极性非质子溶剂，如NMP、DMAc和MeCN，在反应20 h后转化率最高（转化率>98%），并产生适量的杂质19和20（0.3-1.5 %）。相反，极性较小的溶剂如异丙醇、叔戊醇、四氢呋喃和2-甲基四氢呋喃的反应转化速度较慢，但杂质19和20的生成也受到抑制。使用NMP获得的结果有利于达到可靠的高转化率（>99%）和适用于下面后处理过程。
此外，为了从SNAr反应中去除过量的未反应化合物2，作者开发了一种萃取后处理，即在中间体18的存在下，通过选择性水解生成相应的烟酸钠21来清除过量的2（Scheme 9）。首先，将反应结束的混合物加稀盐酸水溶液再用MTBE萃取，可有效地将残留的三乙胺和氮杂环丁烷原料7转至酸性水层。接下来，有机层用稀氢氧化钠水溶液处理并升温至40℃反应1h，从而实现2到21水解。分离各层后，从有机层中清除烟酸甲酯2，在水层中检测到相应的羧酸盐21，仅生成痕量产物1。最后用氯化钠水溶液洗涤，得到澄清的有机物流，导致水解反应和1的分离。
因此，可通过增加SNAr反应中化合物2（1.3 当量）的负载量，从而使杂质19最小化（0.4 %）。通过上述的相关优化，可实现公斤级的放大（Scheme 10）。中间体18用氢氧化钠、水和THF处理以水解酯，然后用盐酸质子化并萃取到MeTHF中。游离酸1通过从甲基四氢呋喃/庚烷中结晶，可获得82%收率，纯度为98.3%。
总结：本文主要对候选药物1的两种途径进行了评估，以满足早期开发的需求。同时，对于新开发五步合成工艺，可避免柱色谱的分离，并且可实现公斤级的放大，从而满足临床需求。此外，该工艺还对反应过程中产生的杂质进行了相关的研究。
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