再创 丨中国团队开发高性能细胞通讯系统，解决多细胞系统工程难题
—文章第一作者、北京大学博士、现蓝晶微生物联合创始人兼CEO 张浩千
作者：孟凡康
帝国理工学院在读博士，再创主编
在多细胞生物中，接触式细胞通讯、短途（自分泌）、中途（旁分泌）和长途（内分泌）范围的细胞间信号通讯是控制多细胞系统功能分工、时空发育，免疫应答以及维持生理稳态的关键。类似于协调计算机中大量计算单元的电子线路，细胞间通讯—这条化学线路指导了多细胞系统中不同细胞之间的协作过程。
在合成生物学领域，我们已经开发了多种合成人工通讯系统，如synthetic quorum sensing, scalable peptide-GPCR signalling、synthetic morphogen system等等。然而，现有优质的细胞间通讯工具仍然有限，主要有两个方面限制了这类工具的实用性：
① 通用性：理想的细胞-细胞通讯系统应该以模块化的方式工作，同时需要满足跨生物界（细菌、真菌、动物等）通讯的场景，能够兼容或者迁移到多种细胞类型。然而，现有的系统要么需要人工添加外源性前体用于合成信号分子，要么无法从一个物种转移到另一个物种上，在不同生物底盘中的兼容性很差。
② 正交性：理想的细胞-细胞通讯系统依靠一系列绝缘性良好的通道来进行正确的信号传递。在电子产品中，不同通道的绝缘可以通过空间隔离来实现的，而在生物系统中，最可行的实现绝缘的方法是通过「化学正交 chemical orthogonality」。但是现有的细胞间通讯工具正交性很差，在同一个细胞或者群体中使用时会相互产生干扰。
为了解决上面提到的问题，来自中国科学院、北京大学以及蓝晶微生物的研究团队基于群体感应系统（Quorum Sensing）从头设计了一整套具有通用性高、正交性强、可以跨生物界通讯的合成生物学工具箱，相关文章发表在Nature Communications上。通过对元件挖掘、理性设计以及定向进化，这项工作一共开发了10套全新或优化过的细胞通讯工具，其综合性能远超传统的群体感应信号系统。这套工具将极大地扩展合成生物学在多细胞生物工程中的能力，为在细胞进行大规模生物计算提供了坚实的基础，也为包括人工生态系统和智能组织在内的复杂多细胞工程铺平了道路。
再创对文章进行了解读，并对三位文章第一作者进行了专访，在此与各位读者共享。
I 解决通用性：从通用的细胞代谢物出发
为了设计超越现有水平的细胞通讯工具，关键的一个环节在于通用性。毕竟我们总可以在同一种生物底盘中不断优化，将一套通讯工具调谐到较高的性能，但是这仍然无法满足未来在异质多细胞系统应用的需求。
为了解决细胞间通讯系统的通用性问题，研究人员提出了新的开发策略：选择「保守的细胞代谢物」作为信号分子的前体分子，同时为前体分子设计出小型的信号分子生物合成途径。这样一来，即使生物合成途径导入到差别较大的生物底盘之中，也可以利用同样的前体分子合成最终的信号分子，极大的扩展在不同细胞系统之间的通用性。
研究人员在Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 数据库和文献中对次级代谢物数据和对应的转录调控因子按照以下标准进行了筛选：
(iv) 合成此信号分子的生物途径包含的酶总数最少。
从通用的细胞代谢物出发筛选有潜力的细胞间通讯系统
研究人员最终筛选出了10个候选的细胞间信号通讯系统，来自于多种物种，包括Pseudomonas, Rhodobacter, Streptomyces, Photorhabdus, Bradyrhizobium, Yersinia以及高等植物。在后续的测试中，10个候选系统中的6个系统达到了较为理想的信号响应效果。
同时研究人员还在工具箱中添加的四个经典的QS通讯系统。所以这项工作中一共获得了10套包括6个全新设计以及4个优化过的的细胞通讯系统。后续研究人员通过启动子理性设计、转录因子定向进化等策略对相关元件进行了优化，使得这10套系统均达到了较高的性能水平。
文章第一作者，中科院微生物所副研究员杜沛博士在回答再创的「理性设计、定向进化、元件挖掘是如何在这篇工作中协作的？」提问时说道：“这三者在总体设计中都有不同程度的体现。元件挖掘、元件刻画的结果是理性设计的前提。根据初步刻画的结果，我们有针对性的对一些群体感应系统的启动子进行了理性设计，替换了天然的启动子，使其具有更好的性能参数（动态区间、本底、灵敏度等等）。有些系统原本没有天然的启动子，所以我们一开始就通过理性设计，设计了好几个版本的合成启动子，然后根据测试结果取参数最优的设计，如文章中的IV、pC系统。理性设计的还有合成信号分子的系统：我们从不同物种中挖掘酶，然后人工搭建了大部分信号分子的合成途径。我们必须确保能在不外加任何基础培养基之外营养物质的情况下，在大肠杆菌中产出足够的小分子。这一体系需要很多调试，也是导致细胞通讯系统设计失败最大的因素。定向进化是一个相对晚一些采用的策略，目的是为了改善部分构建完成的通讯系统的性能，比如提高信号接收系统的灵敏度。”
II 通用性设计打破了不同生物界之间交流的障碍
为了实现跨物种和跨生物界的通信，信号发送模块和接收模块需要有能力在各种细胞模型中发挥作用。「通用的代谢分子」设计策略为打破不同生物界之间交流的障碍提供了最必要的保障。
通过利用物种特异性启动子替换大肠杆菌启动子，研究人员建立了跨生物界的细胞通信系统，包括(i)从大肠杆菌到酵母的DAPG-PhlF通道，(ii)从酵母到大肠杆菌的Sal-NahR通道，以及(iii)从HEK-293T人细胞系到大肠杆菌的pC-RpaR通道。所有的通讯系统都成功地激活。这充分展示了这些通讯工具的通用性及其跨生物界交流的能力。
杜沛在接受采访时提到：“通用性的意义在于最大化细胞通讯系统的适用场景，使我们的工作更加有用。我们设计的系统是在大肠杆菌中刻画的，但我们的目的绝不是单单为了在大肠杆菌中使用，那样细胞通讯的意义和使用场景就大打折扣了。例如，比如对发酵进行自动控制，需要考虑的目标宿主往往是细菌、放线菌、链霉菌等原核生物，也可能是酵母这种真核单细胞生物；对多细胞行为进行建模或者人为控制等研究，也不可能局限于大肠杆菌。由于我们成功的在哺乳动物细胞中完成了细胞通讯的迁移，打开了更多的可能性。比如基于哺乳动物细胞之间的通讯，可以研究细胞分化、组织发育等，乃至未来人造器官的建造等。这些最终都离不开通用性的细胞间通讯工具。当然，在将某个系统转移到一个新的物种中的时候，需要很多调试和修改，但其信号分子是不变的，基本的信号分子合成途径和感应原理也是不变的。”
III 解决正交性：利用生物合成分子与转录因子的多样性
当多个通讯通道集成在同一基因线路中时，可能会在「信号感应」和「启动子响应」两个层面发生干扰。传统上，它们分别被定义为「信号交叉干扰」和「启动子交叉干扰」。
文章共同第一作者，中科院微生物所助理研究员赵会伟在接受采访时说：“生物元器件的模块化与正交化是合成生物学，特别是在设计复杂基因线路过程的基础科学问题。模块化和正交化是元件可预测地组装的必要条件。在细胞间通讯工具中，正交化可以确保多通道交流不相互干涉。”
在10个开发的通讯工具中，四个经典的的QS通道（C4，3OC6，C8和3OC12，在黄框中突出显示）表现出较明显的交叉干扰性，但六个新设计的通道（在红框中突出显示）无论是在信号感应层面还是启动子响应层面有显著较低的交叉干扰。这种显著的正交性正是源于这些信号系统高度不同的组成结构——生物合成小分子的化学多样性和小分子传感转录因子的丰富元件库带来了巨大的设计探索空间。
“这种设计的成功强调了一个普遍的原则，”文章在讨论部分进一步解释道，“自然发生的生化机理并没有探索所有可能的解决方案 —「够用就行」，虽然自然是“偷懒”的，但是这为合成生物设计留下了几乎无限的设计空间。”
（本图修改自Nature评述：Build life to understand it）
IV 高性能的正交性工具带来更复杂的细胞设计
目前在细胞中进行复杂生物学计算的工程进展并不顺利。这在很大程度上是由于我们对大型基因线路的编程能力非常有限：不仅存在工具缺乏的问题，而且复杂基因线路在细胞中很容易过度占用细胞资源，并且在进化上并不稳定。
「将不同的生物计算模块封装到不同的细胞中，然后将不同的细胞连接起来，采取分而治之的策略」是突破复杂基因线路设计瓶颈的潜力方案。这种策略理论上可以在细胞水平实现稳定性、可编程性以及计算复杂性。这项工作中开发的工具正为这样的设计理念提供了重要的支撑。
为了演示更复杂的多细胞生物计算功能，研究人员设计了复杂的三输入XOR-AND逻辑门电路。XOR-AND逻辑门电路分别部署在七个不同的大肠杆菌菌株中，由四个通信通道协调。每个菌株包含一个NOR门(cell-1至cell-6)或一个Buffer门(cell-7)。这是已知第一个同时利用四个通信通道的生物计算线路。
赵会伟在接受采访时说：“通过四套系统共用，我们在大肠杆菌中实现「3 Input-8 Output」的基因线路设计，7个细胞之间的生物计算最终都能输出正确的信号，这是一个不小的突破。因为细胞没有理由按照你的想法工作，让他们在同一时空下协同起来工作，还是有难度的。前6个细胞是NOR gate，每个细胞必须有清晰的ON/OFF，同时小分子的生产强度、扩散的速率和浓度、细胞间接收的速率、响应区间与灵敏度等都需要系统考虑到。”
V 更好的细胞通讯系统能为合成生物学带来什么？
细胞-细胞通信在自然界中无处不在。从工程的角度来看，这些广泛的自然通信系统提供了大量的合成通信元件储备，包括信号分子、高度特异性的受体和转录调控因子等。这项研究从自然界具有通讯潜力的通用代谢分子挖掘出发，提出了一种细胞间通信通道的从头设计路线，利用理性设计以及定向进化开发了10套全新或优化过的细胞通讯工具，其综合性能远超传统的群体感应信号系统。
对于这项工作能够为合成生物学带来的影响，文章第一作者、北京大学博士、现蓝晶微生物联合创始人兼CEO张浩千在接受采访时表示：“在整个生物演化过程中，细胞间通讯对于生物从单细胞走向多细胞是至关重要的一环。合成生物学作为旨在“再创”生命的学科，一直都很缺乏用于设计细胞间通讯的元件，既有的元件不仅具有很强的相互干扰，而且数量极为有限，能应用在人类细胞中的更是少之又少。但不论是发酵生产、治疗癌症还是人造器官，细胞间通讯都是不可被忽略的工程对象。我认为这项工作是合成生物学领域的及时雨，为合成生物学从单细胞向复杂生物群落和组织器官的跨越提供了有力工具。”
杜沛也补充到：“谈到这项工作的意义，具体而言，我们不应该去讲任何单一应用场景。合成生物学的终极目标——合成生命，并不是合成单细胞生命。那么，如何跨越单细胞到多细胞的鸿沟？细胞间的通讯就是无法绕过的能力。虽然距离合成生命还很远，我们至少是在通往未来的道路上铺就了一块地砖。具体到应用场景上，我们开发的这套工具可以支持从单细胞到多细胞研究层次：不论是基础研究还是应用研究，也不论这种研究现在使用的模式物种是什么。这套工具的通用性和正交性都是为此做的保障，相辅相成，缺一不可。自动发酵控制、多细胞行为建模、细胞分化，乃至人造器官等都是可以应用到的场景。但作为支持性的元件，未来可能被应用在完全意料之外的场景。”
之前再创的文章中也提到了著名合成生物学研究者Chris Voigt对于未来合成生物学发展的设想：未来我们将从单个细胞转到系统。
在2030年之后，产品将转向「系统」，而不是单个细胞或者体系。在这些系统中，经过设计的生物细胞可以作为群体协同工作，或者集成到非生命材料或电子产品之中。在农业方面，工程植物和细菌共生物相互协同，作为一个整体控制基因表达来响应不同的环境条件。未来的汉堡肉饼可以使用细菌、真菌和牲畜细胞群体来生产，它们可以共同建立复杂的结构合成具有独特营养和风味的分子。建筑材料可以嵌入活改造的细胞实现自我修复或清除空气污染的功能。包含在油漆总工程生物系统可以防止船体生物污染、减少管道腐蚀活着稳固土壤结构。工程活细胞与电子设备耦合产生的机器人可以利用自然环境中的能量，使用生物传感器进行导航或者实现更好的脑机结合。
再创，公众号：再创丨Regenesis再创丨六种正在改变世界的合成生物学产品
这项来自中科学院、北京大学以及蓝晶微生物合作完成的工作正为实现这些激动人心的前景奠定了重要的基础。未来可期！