林兰教授辨治糖尿病周围神经病变的临床经验挖掘及相关机制研究

糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的慢性并发症之一,该病可严重影响患者的生存质量、增加糖尿病患者的致残率和死亡率。目前该病的发病机制尚不明确,针对该病的有效防治药物也非常有限。林兰教授对糖尿病及其并发症的防治研究已达50年,她对糖尿病周围神经病变的中医病因病理、治疗等方面认识非常深刻,创造出了许多独特有效的治疗方法,糖痛方就是其防治糖尿病周围神经病变的临床精华之一。本论文在导师林兰教授“糖尿病三型辨证理论”学术思想的指导下,首先对其防治糖尿病周围神经病变的中医辨证论治经验进行了系统的挖掘和整理,然后以体外培养的雪旺细胞作为研究对象,采用中药血清药理学方法,从细胞凋亡的信号传导通路探讨糖痛方治疗糖尿病周围神经病变的可能分子机制。 一、临床研究 目的：对林兰教授治疗糖尿病周围神经病变的临床病例进行数据挖掘分析,总结林兰教授对糖尿病周围神经病变的中医病因病机认识及其辨证分型和方、药应用特点。为提高林兰教授经验传承研究的效率及水平,为总结、提炼和优化糖尿病周围神经病变中医药防治规律提供临床循证依据。 方法：将2011年1月-2014年1月林兰教授在广安门医院内分泌门诊确诊的105例糖尿病周围神经病变患者的470诊次的诊疗病例整理成结构化临床诊疗电子病历。将电子病历、评分量表、检查化验结果、方药的全部数据导入数据仓库,利用多维检索分析平台进行分析。统计分析DPN患者的一般资料、理化检查结果、症状和证型特点、林兰教授用药特点。 结果：1、DPN患者一般资料统计：105例DPN患者中男性占52.4%、女性占47.6%；无家族史的占77.1%、有家族史的占22.9%；年龄小于50岁的占14.3%、50-59岁的占32.4%、60-69岁的占28.6%、大于70岁的占24.8%；糖尿病病程小于1年的占3.8%、1-10年的占59.2%、11-20年的占30%、大于20年的占6.7%。2、患者症状分析：将患者各个症状按照出现的频次统计。结果显示,下肢的感觉和运动异常症状中肢体麻木症状出现的最多,其次为肢体发凉、肢体疼痛、肢体浮肿,而肢体强急或瘫软无力症状出现的最少。从其他症状和舌脉证出现的频次分析,属于血瘀证、气虚证的症状出现的最多,阴虚和阳虚症状出现的频次居中,热盛的症状出现的最少。3、DPN患者证候要素提取的分析：以单一症状分析,DPN各类证候中以气虚证、阳虚证、阴虚证最为常见,瘀血证、痰湿证、热盛证其次。但各证型之间常常相互组合出现,在二证、三证、四证组合中可以看出,出现频次最多的是气阴两虚证,而且在气阴两虚基础上,气阴两虚夹瘀证要多于气阴两虚夹痰湿证；阴阳两虚证其次,在阴阳两虚的基础上,阴阳两虚夹痰湿证要多于阴阳两虚夹瘀血证；阴虚热盛证出现的最少,而且阴虚热盛夹痰湿证和瘀血证出现的频次均少于10次。依据数据挖掘结果推断DPN的临床主要证候类型是气阴两虚夹瘀证和阴阳两虚夹痰湿证。

4、林兰教授临床用药分析：汇总林兰教授治疗的105例DPN患者、470个诊次中使用的所有中药处方,将处方中所有中药按照药物出现的总频次数进行排序,统计用药频次超过10次的药物作为高频中药,共选取中药69味。参考第七版《中药学》教材及《中华本草》,将69味高频中药按照功效进行分类,统计结果显示,林兰教授治疗DPN使用最多的是补虚药、活血化瘀药,其次为安神药、收涩药、理气药、化痰药、化湿药、平肝熄风药、清热药。在补虚类药物使用时以补血药和补气药为主,补阴药和补阳药为次。将69味高频中药按照药物的归经进行分类,结果显示林兰教授治疗DPN使用的药物中归心经的药物最多,其次为肝经、肾经、肺经、脾经、胃经、大肠经、胆经、膀胱经、心包经、小肠经、三焦经。5、采用Liquorice数据挖掘系统对高频中药,进行基于功效的聚类分析,统计出了林兰教授治疗DPN的组方配伍规律,即核心复方配伍规律和常用的药对配伍规律。 结论：糖尿病三型辨证理论是临床辨治糖尿病及其并发症的核心理论基础,糖尿病周围神经病变的辨证论治是在三型辨证理论指导下的扩展和延伸。气阴两虚是糖尿病周围神经病变的发病基础,阴阳两虚是病情加重的重要原因；瘀血、痰、湿是主要致病因素,该病病变涉及五脏系统,症状表现复杂,根据临床症状特点可将糖尿病周围神经病变分为四型：气阴两虚脉络瘀阻型、阴阳两虚寒湿痹阻型、肝肾阴虚血不荣经型、脾胃两虚痰瘀互阻型。本课题首次利用结构化临床诊疗信息采集系统,最大程度地收集到全面、规范的病例资料,从“病—症—证—治—方—药”等各个角度对林兰教授治疗糖尿病周围神经病变的临床经验进行分析,总结出了林兰教授对糖尿病周围神经病变的中医病因病机认识及其辨证分型和方、药应用特点。为名老中医经验的继承和发扬提供了一定的借鉴。

二、实验研究 目的：从细胞凋亡的信号传导通路探讨糖痛方治疗糖尿病周围神经病变的分子机制。 方法：本课题从SD乳鼠的坐骨神经中培养出雪旺细胞,并使用含50mM高糖的培养液干预72h,诱导出雪旺细胞的凋亡模型。采用cck-8法筛选出糖痛方含药血清、糖痛方中的主要有效成分盐酸川芎嗪、黄芪多糖,促进雪旺细胞增殖的最佳浓度,作为干预雪旺细胞凋亡的药物浓度。实验共设立对照组、高糖组、糖痛方组、川芎嗪组、黄芪多糖组5个组别,分别采用AV/PI双染法观察各组细胞凋亡率、用TUNE1免疫荧光染色法观察凋亡细胞形态、用WesternBlot法以及RT-PCR法观察凋亡相关基因与因子(bcl-2、bax、Caspase-3、 Caspase-9、Cytochrome C、Fas、FasL、ICAM-1)蛋白和nRNA表达的变化。从多方面观察、比较中药糖痛方及其主要有效成分对高糖诱导的雪旺细胞凋亡的干预作用。

结果：1、本实验采用组织块培养法、差速贴壁法、低浓度胰酶消化法相结合,培养出了纯度达85%的原代雪旺细胞。实践证明该方法培养出的原代雪旺细胞,不仅纯度高、活性好而且可重复性佳,为后续的实验研究奠定了基础。2、本实验采用Annexin V/PI双染、流式细胞仪检测法观察出不同高糖浓度、不同干预时间以及不同细胞培养密度条件下的雪旺细胞凋亡情况,经过多次重复实验,最终确定以50mM的高糖干预的第48-72h作为雪旺细胞凋亡模型最适宜。3、采用CCK-8法证实了糖痛方含药血清对高糖导致的雪旺细胞增殖抑制状态有显著的逆转作用。糖痛方药物的主要有效成分：黄芪多糖在160mg/L-3200mg/L浓度之间、盐酸川芎嗪在4mg/L-200mg/L浓度之间时具有明显促进雪旺细胞增殖的作用,并且其增殖作用随时间的延长而增强。随后我们在两种药物的有效浓度中各选取了高、中、低三个干预浓度,将其作用于高糖培养的雪旺细胞,实验结果进一步证明盐酸川芎嗪和黄芪多糖有促进雪旺细胞的增殖作用,而且这种作用也可以明显改善高糖对雪旺细胞增殖的抑制作用。4、通过Annexin V/PI双染法、TUNE1免疫荧光染色法检测了糖痛方及其主要有效成分对高糖诱导的雪旺细胞凋亡的影响,结果显示,经高糖作用72h后雪旺细胞发生明显凋亡,与对照组相比高糖组和川芎嗪组凋亡最显著(P<0.05),黄芪多糖组、糖痛方组的凋亡率与对照组相比均增加,与高糖组相比均有显著降低(P<0.05)。糖痛方组与黄芪多糖组相比无显著差异,与川芎嗪组相比差异显著(P<0.05)。5、Western Blot法检测结果显示,各干预组的bcl-2/bax的比值与对照组相比均显著降低(P<0.01),这表明对照组细胞分泌的抗凋亡蛋白占主导,对细胞有保护作用,而其余各干预组经高糖干预后促凋亡的蛋白过度表达,从而导致细胞凋亡发生。经高糖刺激后各干预组Fas、FasL、Cytochrome C、Caspase-9、Caspase-3、ICAM-1蛋白表达量均增加,其中高糖组增加最明显,与对照组相比(P<0.01或P<0.05),糖痛方组增加最少,川芎嗪组和黄芪多糖组介于两者之间。6、RT-PCR法检测结果显示,糖痛方组各种凋亡相关基因和因子的mRNA表达量与对照组相比均无明显差异；高糖组与对照组相比bcl-2mRNA表达量显著降低(P<0.01), bax、Cytochrome C、Caspase-9、 Caspase-3、ICAM-1mRNA表达量显著增高(P<0.01)；川芎嗪组和黄芪多糖组各凋亡相关基因和因子的mRNA表达量介于高糖组和糖痛方组之间。 结论：以益气养阴活血化瘀为主要作用的糖痛方能通过改变凋亡相关基因、因子及ICAM-1的活化与表达来抑制高糖环境对雪旺细胞凋亡的影响,从而起到保护周围神经,预防和治疗糖尿病周围神经病变的作用。糖痛方中的主要有效成分盐酸川芎嗪和黄芪多糖单体也能在不同程度上抑制高糖所致的雪旺细胞凋亡,说明方中的益气药和活血药在治疗过程中起了重要作用,但中药复方的效果优于单味药和单体的作用。...