吃透这个套路的你一年也能发5+篇SCI！
Screening and identification of genes associated with cell proliferation in cholangiocarcinoma
胆管癌细胞增殖相关基因的筛选与鉴定
一、 研究背景
胆管癌（CCA）是一种预后较差的侵袭性肿瘤，发病率和死亡率均在增加。而CCA对常规的放疗和化疗都不敏感，因此探究CCA中的关键基因以及发现和设计潜在的药物靶标至关重要，尤其是在肿瘤发生的关键生物学过程（如细胞增殖）中。因此，作者通过全面的泛癌分析确定了一些细胞增殖相关的基因，这些基因可能成为分子靶向治疗中潜在的未来靶标。
二、 分析流程
三、 结果解读
1. 胆管癌的基因表达概况
作者对TCGA-CHOL的RNA测序数据，通过DeSeq2软件包筛选表达失调的基因。在图1A中展示了CCA的基因表达谱。接着，作者对异常表达基因和等数目的正常表达基因进行随机测试，发现只有少量的异常表达基因是功能基因（图1B），显示功能基因可能由于其重要的生物学作用而受到严格调节与稳定表达。
在补充材料1E中，作者提到：在这些失调基因中可以检测到癌症的特征（例如生长信号的自足和抗生长信号的不敏感性），该结果提示这些异常表达的基因在肿瘤发生中有重要的生物学作用。
为了进一步了解CCA的基因表达，作者筛选了94个显著的表达失调基因。在16个癌症类型中进行测试，发现这些基因在至少9种癌症中异常表达（图1C）。这提示失调基因的异常表达与肿瘤的发生潜在相关。
图1C：CHOL中94个失调基因表达分布的泛癌分析
由于TCGA-CHOL的样本量太小，因此作者结合LIHC（肝细胞肝癌）和PAAD（胰腺癌）在TCGA数据库的临床数据进行分析。图1D是KM生存分析，展示这些失调基因（包括BIRC5和HRG）的表达可能与预后相关。此外，作者使用配对样本展示BIRC5和HRG的表达模式（1E和补充图1F），可见肿瘤样本相比正常样本，基因表达显著差异。但在不同的癌症样本间表达相对稳定。
图1D-E：失调基因在多种癌症样本中的表达谱
2. 细胞增殖相关基因的筛选
由于细胞增殖过程对肿瘤的发生发展至关重要，因此其涉及的基因在不同的癌症类型中应展现出一致的特征。MK167是一种典型的增殖标记，是细胞增殖的关键基因。同时，作者引入了10个已知的乳腺癌细胞增殖相关的基因（BIRC5，CCNB1，CDC20，CEP55，NDC80，TYMS，NUF2，UBE2C，PTGGI和RRM2）。将这11个基因用于CCA中细胞增殖相关基因的筛选。
在TCGA样本中检测该11基因的表达。可见在CCA中表达显著上调，且在其他大多数癌症中表达也上调（图2A）。
接下来，作者对CCA数据中的94个失调基因（图1C中展示）进行全面的相关性分析，有15个基因与MKI67以及至少其他三个基因表达正相关（图2B）。图2C是相关系数r的分布图，可见筛选出的15个基因在不同癌症类型中显示正的r系数，提示这些基因的过表达与癌症形成有关。
至此，作者得到了一份26个细胞增殖相关基因的列表。这26个基因在不同癌症类型之间展现动态表达，但是可一致地观察到过表达模式（2D），这种在各种癌症中稳定过表达的模式意味着这些基因对癌症的发生发展至关重要。
3. 功能分析展示26基因的重要生物学功能
为了进一步了解这26个基因与癌症的关系，作者研究了其关键的细胞作用及生物学功能。图2C展示了在26个基因中，有17个被认定为核心基因，14个是致癌基因，11个在KEGG pathway中富集，9个与癌症的特征有关。GO分析可见有8个GO术语被富集（图3A）。
在补充材料中，作者还列举了主要富集的通路和癌症标志。这些结果表明筛出的26个基因具有重要的生物学作用，尤其是在细胞增殖有关的通路和生物学过程中。
图3A：使用David平台，基于26个候选基因显著富集的GO术语。
作者还预测了基因表达与其他疾病的关联。作者使用clusterProfiler绘制了这些关联。图3B展示了94个失调基因富集的多种疾病类型：包括口腔恶性肿瘤，浸润性导管癌，慢性肝病，血栓形成和肝硬化。图3C展示了26个与细胞增殖相关的基因富集的多种疾病类型：浸润性导管癌，视网膜母细胞瘤和多囊卵巢疾病。以上的两次富集分析其实都涵盖了15个CCA中的细胞增值相关基因，但是只有浸润性导管癌是共同富集的疾病类型。
图3B-C：基因的疾病富集网络
4. 26个基因的潜在合成致死遗传相互作用
合成致死是一种遗传相互作用，是一种前景明亮的潜在抗癌策略，可以用于鉴定治疗靶标。对于这26个细胞增殖相关基因，作者对这26个基因与其他基因之间的潜在的负面遗传作用进行探究。
图4A和B中，作者分析了这些基因在33种癌症类型中的突变谱，可见在8种癌症类型中，可以检查到所有的26个基因的突变；而在CCA患者中，仅有4个基因发生了突变，这可能因为其样本量过小导致的。
根据已知的合成致死的基因对，作者筛查了这26个基因潜在的基因对。在23个候选基因与另外213个基因之间检测出284个基因对。其中，75%的基因检测出1次相互作用，有11个基因（有10个是作者鉴别出来的候选基因）出现了10次以上的相互作用，尤其的，对TYMS检测出93种相互作用（图4C）。
此外，使用Cytoscape绘制的基因相互作用网络表明，这些基因在CCA患者中展现出多种表达模式，其中过表达模式占主要地位（图4D）。同时在CCA患者中，RECOL4，TOP2A，MK167和ASPM这四个突变的基因与其他基因有复杂的相互作用，与一些基因的表达还有明显的正相关。
图4：CCA中潜在的合成致死遗传相互作用。
5. 26个基因在癌症通路活性和药物反应中的潜在作用
为了了解这26个候选基因的潜在相关癌症通路的作用，作者使用GSCALite进行了相关分析。这种分析使我们能够预测基因在癌症相关生物通路中的激活或抑制作用。
图5A可见大多数这些基因在相关通路中展现出一致的作用：包括在细胞周期和凋亡通路中的激活作用，以及在RAS / MAPK通路中的抑制作用。这些结果表明，26个候选基因总是在癌症样品中异常富集，过表达（图2的结论），从而推断出这些基因的异常表达与癌症进程有关系。
接下来，考虑到基因与癌症发生之间的关联，作者分析了他们的潜在药物反应，了解其作为药物靶标的潜在作用。对于特定的药物，大多数基因表现出一致的药物-基因关联性。表明存在复杂的药物-基因相互作用。在这26个基因中，只有3个基因在CCA中有明显的药物反应（图5B）。
图5D是KM生存分析，可见候选基因TPX2与LIHC和PAAD的预后显著相关。在补充材料4C和D，作者对每一个基因都进行了KM生存分析，结果证明该26个候选基因潜在的预后价值。
图5：药物-基因的相互作用和某些基因的潜在生物学作用。
6. 蛋白质表达谱和实验验证失调的蛋白质
功能分析表明，某些基因可能是潜在的药物治疗靶标。为了验证这些基因的表达水平，作者在配对的CCA组织样品中使用Triple TOF 5600进行了蛋白表达谱分析。
首先作者查询了94个失调基因的蛋白表达谱，发现其中39个基因蛋白质高表达（图6A）。接着对26个表达上调的基因进行分析，发现有4个基因的蛋白质和RNA水平为一致的高表达（图6B和C），这证实了他们的致癌作用。
在图6D中，对这4个一致高表达的基因，作者进一步基于多种癌症类型进行药物分析，证实CENPF可能是潜在的药物靶标。图6E和补充图4E展示这四个基因在生物学途径中具有重要作用，包括在EMT途径中的激活作用，而CENPF在凋亡，细胞周期和DNA损伤反应中具有重要的激活作用。
最后，在图6F-H中，进一步的实验验证表明，在四种细胞系中COL10AI和CENPF均显着上调，CTHRC1在HCCC-9810细胞系中显着上调。COMP表达在CCT细胞系中显着上调，但在其他细胞系中显着下调。
图6：通过蛋白谱分析相关蛋白的表达模式。
小结
在本文中，作者基于11个经过验证的基因在CCA中筛选了15个潜在基因，并进一步探究了这26个基因，以描述其生物学功能和在癌症治疗中的潜在作用。其中一些涉及合成致死的遗传相互作用，尤其是对于RECQL4，TOP2A，MKI67和ASPM，实验表明它们在药物设计和癌症治疗中的潜在作用。进一步的实验验证表明，某些基因的表达在几种癌细胞中显着上调，这暗示它们在肿瘤发生中的重要作用。