临床试验加RNAseq找标志物发10+分！
A Molecular Signature associated with prolonged survival in Glioblastoma patients treated with Regorafenib在接受Regorafenib（瑞戈非尼）治疗的胶质母细胞瘤患者中与延长生存期相关的分子signature
一、研究背景
胶质母细胞瘤(GBM)恶性程度很高，患者预后极差，但最近一项REGOMA试验表明抗血管生成药物Regorafenib对复发性GBM患者有延长生存期的效益。考虑到GBM存在较大的遗传异质性，作者希望找到GBM中与药物疗效差异相关的分子生物标志物，为临床药物应用提供一些参考。
二、分析流程
三、结果解析
1.生存相关转录本筛选
作者从REGOMA临床试验中接受两种不同药物治疗的GBM患者(regorafenib n=36；lomustine n=36)的肿瘤组织FFPE切片中提取了RNA并进行了测序。为筛选出潜在的预后相关转录本，作者将测序结果中每个mRNA的表达水平与患者的总生存期(OS)以及无进展生存期(PFS)存在的联系进行分析，发现其中11个mRNA在高/低表达时，两个药物治疗组之间的OS和PFS存在显著差异——HIF1A，CTSK，SLC2A1，KLHL12，CDKN1A，CA12，WDR1，CD53 mRNA高表达以及CBR4，NIFK-AS1，RAB30-DT mRNA低表达时，regorafenib治疗组相对于lomustine治疗组具有显著更长的OS(图2)。对PFS的分析也得到相似的结果，但两种药物治疗组之间的差异相对于OS要小。
图2.11个与预后相关的mRNA高/低表达时两个药物治疗组预后的差异
作者进一步对regorafenib治疗组进行了深入研究，希望进一步筛选出可用于判断具有更优疗效的患者亚群的Signature。最终发现HIF1A和CDKN1A mRNA(图4A，B)高表达的亚组相对于低表达组的中位OS显著延长，但对PFS未观测到相似结果。
图4A,B.与regorafenib治疗组患者预后相关的mRNA
总的来说，作者对首次手术取得的肿瘤组织样本进行转录组分析后发现，HIF1A和CDKN1A mRNA的表达情况是一种可用于预测regorafenib治疗的复发性GBM患者OS的分子Signature。
2.生存相关miRNA筛选
由于miRNA是基因表达的关键调控因子，且在GBM患者中已有几种miRNA的表达异常被报道为预后指标，故作者分析了样本的miRNA表达谱，结果发现有10个miRNA高或低表达时，两个药物治疗组之间的OS和PFS会出现显著差异——低表达miR-93-5p，miR-203a-3p，miR-17-5p，let-7c-3p，miR-101-3p，miR-3607-3p，miR-6516-3p，miR-301a-3p，miR-23b-3p和高表达mir-222-3p时，regorafenib治疗组相对于lomustine治疗组具有显著更长的OS(图3)。
为了验证上述10个miRNAs的高或低表达是否可以独立预测OS或PFS，作者比较了依据各个miRNA表达情况划分的高表达组和低表达组的中位OS和PFS，但均未观察到显著差异。随后，作者研究了上述miRNA的高/低表达是否在regorafenib治疗组中对应更好的预后。通过cBioPortal网页工具，作者对TCGA数据集的GBM数据进行了分析，数据基于各个miRNA的表达水平中位数分为两组。分析结果显示在592例接受包括放化疗在内的术后一线治疗方案的GBM患者中，miR-17-5p和miR-222-3p的表达与OS相关。然而，与作者的发现相反的是，TCGA数据库中miR-17-5p高表达和miR-222-3p低表达对应更好的预后，对此情况，需要日后更进一步的分析来阐明原因。
图3.10个与预后相关的miRNA高/低表达时两个药物治疗组预后的差异
为了解所选择的10个miRNA是否能进一步揭示患者对regorafenib治疗的疗效差异，作者根据10个miRNA的高低表达水平将患者分层后比较了regorafenib组患者的OS，发现低表达miR-93-5p，miR-3607-3p和miR-301a-3p的患者预后显著更好（图4C，D，E）。对PFS的KM分析依然未观测到类似情况。此外，在regorafenib治疗组中发现的上述3个miRNA的表达与预后的关联并未在lomustine治疗组中出现，说明该Signature具有一定的特异性。
图4C,D,E.与regorafenib治疗组患者预后相关的miRNA
总而言之，上述结果表明，利用miR-93-5p、miR-3607-3p和miR-301a-3p的表达情况可以区分出经regorafenib治疗后具有明显OS优势的患者。
3.促血管生成基因通路与regorafenib治疗组生存情况
作者在前文中已鉴定出与更长的OS相关的11个基因转录本和10个miRNA，而因miRNA被证实广泛参与转录后基因表达调控，作者希望评估regorafenib治疗组的不同预后表现是否与miRNA介导的表观遗传调控相关。MiRTARBase算法(http://miRTarBase.mbc.nctu.edu.tw)对11个基因转录本和10个miRNA进行分析后，HIF1A被预测为miR-101-3p和miR-93-5p调控的靶点，CDKN1A被预测为miR-101-3p，miR-17-5p，miR-203-3p和miR-93-5p的靶点，WDR1被预测为miR-17-5p和miR-93-5p的靶点(图5B)，上述结果提示——与regorafenib治疗组更好的预后相关的miRNA和mRNA之间可能存在调控关系。
图5A.预后差异相关基因的通路富集分析结果；图5B,C miRNA对基因的转录后调控预测
考虑到regorafenib为多激酶抑制剂，作者希望通过通路富集分析研究哪些分子通路可能与该药物相较于lomustine的生存优势相关。作者在此使用了更宽松的筛选标准，即在regorafenib和lomustine之间的KM分析中以p≤0.05(而非p≤0.01)为阈值筛选预后差异相关基因。对筛选出的差异基因的通路分析结果显示这些基因参与的过程与血管生成密切相关，如HIF1A转录因子网络，整合素信号通路以及在肿瘤中更普遍存在的碳水化合物代谢，天然免疫系统以及抗原加工通路等(图5)。
作者进一步研究了上文以p≤0.05为阈值筛选出的基因中的39个在其他文献中被划分为血管生成相关的的基因，使用MiRTARBase的预测结果显示，有15个基因是先前筛选到的10个miRNA的潜在靶点(图5C)。除了HIF1A之外，miR-93-5p还被预测为VEGFA、CXCL8和CXCL2的转录调控因子，而miR-301a-3p则被预测为TIMP2的预测调控因子(图5C)。考虑到miR-93-5p和miR-301-3p二者在这项研究中的密切联系，作者对分别经过VEGFA，CXCL8，CXCL2和TIMP2的mRNA表达情况分层后的regorafenib治疗组患者进行了KM分析，观察到这四个基因转录本的高表达对应regorafenib组病人更长的OS(图6)。
图6.血管生成相关基因高表达时两个药物治疗组预后的差异
小结
作者的分析思路并不复杂——首先筛选了表达情况与两种药物治疗组间预后差异相关以及与regorafenib组内患者预后差异相关的mRNA和miRNA，随后对mRNA与miRNA之间潜在的调控关系进行了分析，最后探究了regorafenib组相对于lomustine组存在生存优势的相关基因以及这些基因的相关通路还有与miRNA之间的调控关系。作者的研究中包含了湿实验，一定程度上提高了文章的说服力，但没有进一步探索相关mRNA和miRNA涉及的的具体通路以及在不同肿瘤亚类和进程中的变化情况，留下了进一步深入挖掘的空间。